خبرون

Nature.com گهمڻ لاءِ توهان جي مهرباني.برائوزر جو نسخو توهان استعمال ڪري رهيا آهيو محدود CSS سپورٽ آهي.بهترين تجربي لاءِ، اسان سفارش ڪريون ٿا ته توهان هڪ اپڊيٽ ٿيل برائوزر استعمال ڪريو (يا انٽرنيٽ ايڪسپلورر ۾ مطابقت واري موڊ کي بند ڪريو).ساڳئي وقت ۾، مسلسل حمايت کي يقيني بڻائڻ لاء، اسان سائيٽ کي بغير اسٽائل ۽ جاوا اسڪرپٽ پيش ڪنداسين.
ڪينسر جي سيلز سيلولر دٻاء تي قابو پائڻ ۽ ترقي جاري رکڻ لاء مختلف ميکانيزم تيار ڪيا آهن.پروٽين kinase R (PKR) ۽ ان جي پروٽين ايڪٽيويٽ (PACT) ابتدائي جواب ڏيڻ وارا آهن جيڪي مختلف دٻاء جي سگنلن جي نگراني ڪن ٿا جيڪي سيل جي ڦهلائڻ ۽ اپوپٽوسس کي روڪڻ جي ڪري ٿي.بهرحال، سرطان جي سيلز ۾ PACT-PKR رستي جو ضابطو گهڻو ڪري اڻڄاتل رهي ٿو.هتي، اسان ڏٺو ته ڊگهي غير ڪوڊنگ آر اين اي (lncRNA) aspartyl tRNA synthetase antisense RNA 1 (DARS-AS1) سڌي طرح PACT-PKR رستي جي روڪٿام ۾ ملوث آهي ۽ سرطان جي سيلن جي واڌ کي وڌائيندو آهي.CRISPRi 971 ڪينسر سان لاڳاپيل lncRNA جي وڏي پيماني تي فنڪشنل اسڪريننگ استعمال ڪندي، اسان اهو معلوم ڪيو ته DARS-AS1 خاص طور تي سرطان جي سيل جي واڌاري سان لاڳاپيل هئي.تنهن ڪري، DARS-AS1 knockout سيل جي واڌ کي روڪي ٿو ۽ ويٽرو ۾ مختلف ڪينسر سيل لائنن ۾ سرطان جي سيل اپوپٽوسس کي فروغ ڏئي ٿو ۽ خاص طور تي وييو ۾ ٽيومر جي واڌ کي گهٽائي ٿو.مشيني طور تي، DARS-AS1 سڌو سنئون PACT ايڪٽيويشن ڊومين سان ڳنڍيل آهي ۽ PACT-PKR رابطي کي روڪي ٿو، ان ڪري PKR چالو ڪرڻ، eIF2α فاسفوريليشن، ۽ اپوپٽوٽڪ سيل جي موت کي روڪڻ.ڪلينڪ طور تي، DARS-AS1 وڏي پيماني تي ڪيترن ئي ڪينسر ۾ ظاهر ڪيو ويو آهي، ۽ هن lncRNA جي اوور ايڪسپريشن هڪ خراب تشخيص جو اشارو آهي.هي مطالعو DARS-AS1 lncRNA پاران PACT-PKR رستي جي ڪينسر جي مخصوص ضابطي کي واضح ڪري ٿو ۽ سرطان جي تشخيص ۽ علاج لاءِ هڪ ٻيو هدف فراهم ڪري ٿو.
دٻاء سان مطابقت ڪرڻ جي صلاحيت سرطان جي سيل جي بقا ۽ واڌ جي هڪ اهم خصوصيت آهي.سخت مائڪرو ماحوليات ۾ ڪينسر جي چوٽي جي تيزيءَ سان ڦهلجڻ ۽ ميٽابولڪ نشانين - غذائيت جي محرومي، هائيڪسيا، ۽ گهٽ پي ايڇ - جيڪي سيل جي موت جي سگنلنگ رستن کي ٽريڪ ڪري سگھن ٿا.دٻاء جي حساس جين جي بي ضابطگي جهڙوڪ p535، گرمي جھٽڪو پروٽين 6، 7، KRAS8، 9، ۽ HIF-110، 11، 12، 13 اڪثر ڪري ڪينسر ۾ ڏٺو ويندو آهي، ان ڪري اپوپٽوسس کي روڪيو ۽ بقا کي وڌايو.
پروٽين kinase R (PKR) ھڪ اھم اسٽريس سينسر آھي ۽ يوڪريوٽڪ انيشيئشن فيڪٽر 2α (eIF2α) جو سبونٽ ڪنيز، ھڪڙو ترجمو ڪندڙ ريگيوليٽر آھي جيڪو سيلولر دٻاءُ کي سيل جي موت سان ڳنڍي ٿو.PKR اصل ۾ هڪ اينٽي وائرل پروٽين جي طور تي هڪ غير ملڪي ڊبل-اسٽرينڊڊ آر اين اي (dsRNA) جي ڳولا سان سڃاڻپ ڪئي وئي هئي.چالو ٿيڻ تي، PKR فاسفوريليٽس eIF2α وائرل ۽ سيلولر پروٽين جي جوڙجڪ کي روڪڻ لاء 14,15,16.PACT (PKR ايڪٽيويٽ پروٽين) کي dsRNA 17,18,19,20,21,22,23 جي غير موجودگي ۾ پهريون PKR ايڪٽيويٽ پروٽين جي طور تي سڃاتو ويو آهي.PKR سان سڌي رابطي جي ذريعي، PACT مختلف دٻاءُ (سيرم ستو، پيرو آڪسائيڊ يا ارسنائيٽ علاج) کي PKR ۽ هيٺئين دڙي جي سگنلنگ رستن ڏانهن منتقل ڪري ٿو.eIF2α فاسفوريليشن جي اضافي ۾، PACT-ثالث PKR ايڪٽيشن مختلف واقعن کي متحرڪ ڪري ٿو دٻاءُ جي ردعمل سان لاڳاپيل، بشمول PI3K/Akt24 رستي ذريعي تبديل ٿيل ريڊڪس اسٽيٽس، پي 5325,26 ۽ NF-κB27,28 ذريعي بهتر ڪيل ڊي اين اي نقصان جي چڪاس، ٽرانسڪرپشن، κB27,28 کي منظم ڪري ٿو. انهن جي نازڪ ڪردار کي دٻاء جي رد عمل ۾ ڏنو ويو آهي، ڦهلائڻ، apoptosis ۽ ٻين اهم سيلولر پروسيس، PKR ۽ PACT ڪيترن ئي بيمارين، خاص طور تي ڪينسر 30,31,32,33 لاء علاج جي مقصدن جو واعدو ڪري رهيا آهن.تنهن هوندي، هن pleiotropic فنڪشنل ۽ حياتياتي اهميت جي باوجود، سرطان جي سيلز ۾ PACT / PKR سرگرمي جي ضابطي ۾ رهي ٿي.
lncRNAs 200 نيوڪليوٽائڊس کان وڏيون نقلون آھن جن ۾ پروٽين-ڪوڊنگ جي صلاحيت نه آھي.جڏهن کان جديد پوري جينوم ترتيب ڏيڻ واري منصوبن ۾ هزارين lncRNAs جي نشاندهي ڪئي وئي آهي، 35,36 انهن جي حياتياتي ڪمن کي واضح ڪرڻ لاءِ تمام گهڻي ڪوشش ڪئي وئي آهي.تحقيق جي هڪ وڌندڙ اداري اهو ظاهر ڪيو آهي ته lncRNAs ڪيترن ئي حياتياتي عملن ۾ ملوث آهن جن ۾ ايڪس ڪروموزوم جي غير فعال ٿيڻ جو ضابطو 38,39، امپرنٽنگ 40، ٽرانسڪرپشن41,42، ترجمو43 ۽ حتي ڪينسر جي واڌ44,45,46,47 شامل آهن.انهن مطالعي ٻڌايو ته ڪيترائي lncRNAs شامل آهن PACT / PKR رستي ۾.هڪ اهڙي مطالعي مان ظاهر ٿيو ته lncRNA ASPACT PACT ٽرانسپشن کي روڪيو ۽ PACT mRNA جي ايٽمي برقرار رکڻ کي وڌايو.ٻيا اڀياس ڏيکاريا آهن ته lncRNA nc886 PKR سان ڳنڍيل آهي ۽ ان جي فاسفوريليشن 49,50 کي روڪي ٿو.هينئر تائين، lncRNA ريگيوليٽنگ PACT-ثالث PKR چالو ڪرڻ جي رپورٽ نه ڪئي وئي آهي.
Aspartyl-tRNA synthetase antisense RNA 1 (DARS-AS1) هڪ آنڪوجينڪ lncRNA51,52,53,54 طور سڃاتو ويو آهي.miP-194-5p53، miP-12952 ۽ miP-532-3p51 جي ضابطي جي ذريعي، DARS-AS1 واضح سيل رينل سيل ڪارڪينوما، تايرايڊ ڪارڪينوما ۽ غير ننڍي سيل ڦڦڙن جي ڪارڪينوما جي واڌ کي فروغ ڏيڻ لاء ڏيکاريو ويو آهي.ٽونگ ۽ ساٿين اهو پڻ معلوم ڪيو ته DARS-AS1 پروٽين 39 (RBM39) آر اين اي بائنڊنگ موف جي استحڪام کي برقرار رکڻ سان مائيلوما جي ترقي کي وڌايو.بهرحال، ڪو به مطالعو نه ڪيو ويو آهي ته ڇا هي lncRNA PACT-PKR چالو ڪرڻ ۽ سرطان جي سيلز جي دٻاء جي ردعمل جي ضابطي ۾ شامل آهي.
هتي، اسان CRISPRi سسٽم کي استعمال ڪندي وڏي پيماني تي نقصان جي فنڪشن اسڪرين کي انجام ڏنو ۽ اهو طئي ڪيو ته DARS-AS1 lncRNA ڪيترن ئي قسمن جي سرطان جي سيلز جي واڌ کي وڌايو.ان کان علاوه، اسان ھڪڙي وڏي ميکانيزم جي نشاندهي ڪئي آھي: DARS-AS1 سڌو PACT سان پابند آھي، PACT ۽ PKR بائنڊنگ کي روڪي ٿو، eIF2α جي فاسفوريليشن کي روڪي ٿو، ھڪڙو گھٽ پي آر آر سبسٽٽ، ۽ آخرڪار اپوپوٽڪ سيل جي موت کي روڪي ٿو.نتيجي ۾، اسان جو ڪم ظاهر ڪري ٿو DARS-AS1 lncRNA PACT-PKR رستي جي ريگيوليٽر جي طور تي ۽ ڪينسر جي علاج ۽ پروگنوسس لاءِ هڪ امڪاني حدف.
وسيع جينوميڪ پروفائلنگ مطالعي جي نشاندهي ڪئي وئي آهي سوين lncRNAs ڪينسر سان لاڳاپيل.بهرحال، انهن جو ڪم گهڻو ڪري اڻڄاتل رهي ٿو56.سرطان جي ترقي ۾ ملوث lncRNA اميدوارن کي سڃاڻڻ لاء، اسان CRISPRi سسٽم (Fig. 1a) استعمال ڪندي SW620 ڪولوريڪٽل ڪينسر سيل لائن ۾ گھٽ وڌاءُ لاءِ نقصان جي فنڪشن اسڪرين ڪئي.SW480 ۽ SW620 ڪولن جي ڪينسر سيل لائنن جي منفرد خصوصيت اها آهي ته اهي هڪ ئي مريض ۾ پرائمري ۽ سيڪنڊري ٽيومر مان نڪتل آهن.هي ترقي يافته ڪولن جي ڪينسر جي ترقي ۾ جينياتي تبديلين جي مطالعي لاء هڪ قيمتي مقابلو فراهم ڪري ٿو.تنهن ڪري، اسان آر اين اي جي ترتيب کي استعمال ڪندي کولوريڪل ڪينسر سيل لائنن (SW480 ۽ SW620) جي ٽرانسڪرومس جو تجزيو ڪيو ۽ شايع ٿيل ادب مان ڪجهه امڪاني فنڪشنل lncRNAs گڏ ڪيو.انهن نتيجن جي بنياد تي، اسان هڪ پول ٿيل sgRNA لائبريري ٺاهي آهي جنهن ۾ 7355 sgRNA oligos شامل آهن 971 ڪينسر سان لاڳاپيل lncRNAs ۽ 500 غير ٽارگيٽ ڪيل sgRNA اوليگوس کي منفي ڪنٽرول لاءِ (ضمني ڊيٽا 1).
CRISPRi سسٽم استعمال ڪندي اسڪريننگ جي اسڪيمياتي نمائندگي.ب sgRNA افزودگي کان پوء اسڪريننگ.افقي نقطي واري لائن log2 جي نمائندگي ڪري ٿي (فولڊ تبديلي) = ± 0.58.عمودي نقطي واري لائن اشارو ڪري ٿي p قدر = 0.05.ڪارا نقطا غير ھدف sgRNA (NC جي طور تي نامزد ٿيل) جي نمائندگي ڪن ٿا.ڳاڙهو نقطا sgRNAs آهن DARS-AS1 کي نشانو بڻائيندڙ.نيرو نقطا sgRNAs آھن جيڪي LINC00205 کي ھدف ڪن ٿا، ھڪڙو اڳ بيان ڪيل oncogenic lncRNA.فولڊ تبديلي = (عام پڙهڻ، ڏينهن 17)/(عام پڙهڻ، ڏينهن 0).c DARS-AS1 sgRNA دستڪ ڊائون سيل جي واڌ کي روڪيو.نقص بار جي نمائندگي ڪن ٿا ± ٽن تجربن جي معياري انحراف.* p ≤ 0.05، ** p ≤ 0.01 ٻه-ٽيل شاگردن جي ٽي-ٽيسٽ.d DARS-AS1 اظهار ۾ tumors (TCGA dataset).DARS-AS1 جو اظهار BLCA، KIRC، PRAD، LUSC، UCEC، LUAD، LIHC، KIRP، ۽ COAD، ترتيب سان (TCGA ڊيٽا سيٽ) سان مريضن مان ٺهيل عام ۽ تومور نموني ۾.p-values ​​حاصل ڪيا ويا جوڙيل ٻه-ٽيل شاگردن جي ٽي-ٽيسٽ استعمال ڪندي.
پلاسميڊ ٺاهڻ ۽ لينٽي وائرس کي پيڪنگ ڪرڻ کان پوءِ، اسان dCas9-SW620 ڪولوريڪٽل ڪينسر سيل لائن کي مٿين لائبريريءَ سان چار آزاد انفيڪشن تجربن ۾ منتقل ڪيو.انهن انفيڪشنن لاءِ انفڪشن جي ضرب (MOI) 0.1-0.3 هئي، اهو ظاهر ڪري ٿو ته هر سيل کي صرف هڪ sgRNA سان منتقل ڪري سگهجي ٿو.ويٽرو ڪلچر جي 18 ڏينهن کان پوء، اسڪريننگ کان پوء ٽارگيٽ sgRNAs جي افزودگي پروفائل گهٽجي يا وڌي وئي، جڏهن ته غير ھدف ٿيل ڪنٽرول oligonucleotides جو تعداد اڳ-اسڪريننگ پروفائل جي مقابلي ۾ نسبتا اڻڄاتل رھيو، اھو ظاھر ڪري ٿو ته اسان جو ھدف ھڪڙو اعلي اسڪرين مخصوص آھي. لائبريري.چانور.1b ۽ ضمني جدول 1). LINC00205، جيڪو اڳ ۾ ڦڦڙن جي ڪينسر ۽ جگر جي ڪينسر جي ترقي کي فروغ ڏيڻ لاء ٻڌايو ويو هو 58,59,60، اسڪريننگ ڪيو ويو (log2 (foldchange) < -0.58، p قدر <0.05)، هن اسڪريننگ جي اعتبار جي تصديق ڪندي (تصوير 1b). LINC00205، جيڪو اڳ ۾ ڦڦڙن جي ڪينسر ۽ جگر جي ڪينسر جي ترقي کي فروغ ڏيڻ لاء ٻڌايو ويو هو 58,59,60، اسڪريننگ ڪيو ويو (log2 (foldchange) < -0.58، p قدر <0.05)، هن اسڪريننگ جي اعتبار جي تصديق ڪندي (تصوير 1b). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и рака печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, значение p <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис . 1b). LINC00205، اڳ ۾ ڦڦڙن جي ڪينسر ۽ جگر جي ڪينسر جي ترقي کي فروغ ڏيڻ لاء رپورٽ ڪيو ويو 58,59,60، خارج ڪيو ويو (log2 (fold change) <-0.58، p-value <0.05)، هن اسڪريننگ جي مضبوطي جي تصديق ڪري ٿي (تصوير .1b) . linc0020520 之前 之前 肺癌 被 之前 之前 和 和 和 肺癌 和 和 和 被 筛 选 掉 (被 筛 选 选 <值 <值 <0.0 该 的 的 (筛选 该 该). linc0020520 之前 之前 肺癌 被 之前 之前 和 和 和 肺癌 和 和 和 被 筛 选 掉 (被 筛 选 选 <值 <值 <0.0 该 的 的 (筛选 该 该). LINC00205, о котором ранее сообщалось, что он способствует прогрессированию рака легких и печени58, 59, 60, был исключен (log2 (кратное изменение) <-0,58, p-значение <0,05), что подтверждает надежность этого скрининга (рис . 1b). LINC00205، اڳ ۾ ڦڦڙن ۽ جگر جي ڪينسر جي ترقي کي فروغ ڏيڻ جي رپورٽ ڪئي وئي 58,59,60، خارج ڪيو ويو (log2 (fold change) <-0.58، p-value <0.05)، هن اسڪريننگ جي مضبوطي جي تصديق ڪندي (Fig. .1b).
ٽيسٽ ڪيل سڀني lncRNAs مان، DARS-AS1 کي پڻ اسڪريننگ ڪيو ويو، ٽن ڪوگنيٽ sgRNA oligonucleotides سان خاص طور تي 18 ڏينهن جي ڪلچر کان پوءِ گهٽجي ويو، اهو تجويز ڪيو ويو ته هن lncRNA جي بند ٿيڻ جي نتيجي ۾ ڪينسر جي پکيڙ ۾ گهٽتائي آئي (تصوير 1b).اهو نتيجو وڌيڪ مدد ڪئي وئي MTS تجزيي ۾ ڪولوريڪٽل ڪينسر سيلز ۾ ڏيکاريل آهي ته DARS-AS1 دستڪ ڊائون سيلز جي واڌ جي شرح صرف ڪنٽرول سيلز (Figure 1c) جي مقابلي ۾ اڌ هئي ۽ ڪيترن ئي ٻين ڪينسر جي قسمن جي پوئين رپورٽن سان مطابقت هئي.: صاف سيل گردي جي ڪينسر، تايرايڊ ڪينسر ۽ غير ننڍي سيل ڦڦڙن جي ڪينسر 51,52,53,55.تنهن هوندي به، ان جي فنڪشن ۽ آلوڪيولر ميکانيزم کي کولوريڪل ڪينسر ۾ اڻڄاتل رهي ٿو.تنهن ڪري، اسان هن lncRNA کي وڌيڪ مطالعي لاء چونڊيو آهي.
مريضن ۾ DARS-AS1 اظهار جو مطالعو ڪرڻ لاءِ، اسان ڪينسر جينوم ائٽلس (TCGA) پروجيڪٽ مان 10,327 ٽومر نموني جو جامع تجزيو ڪيو.اسان جا نتيجا ڏيکاريا وڃن ٿا ته DARS-AS1 وڏي پيماني تي ظاهر ڪيو ويو آهي ۽ خاص طور تي صحت مند سيلن ۾ مختلف ٽيمن ۾ وڌايو ويو آهي، بشمول ڪولن ايڊينو ڪارڪينوما (COAD)، رينل صاف سيل ڪارڪينوما (KIRC)، ۽ رينل پيپلري سيل ڪارڪينوما (KIRP)..تمام ٿورا (تصوير 1d ۽ ضمني تصوير. 1a، b). جوڙيل صحتمند/تومور جي نمونن جي تجزيي وڌيڪ تصديق ڪئي ته DARS-AS1 جي هڪ خاص طور تي اعليٰ اظهار جي ٽومر ۾ مثاني urothelial carcinoma (BLCA)، گردئن رينل ڪليئر سيل ڪارڪينوما (KIRC)، پروسٽٽ adenocarcinoma (PRAD)، lung squamous cell carcinoma (LUSC) uterine corpus endometrial carcinoma (UCEC)، lung adenocarcinoma (LUAD)، جگر hepatocellular carcinoma (LIHC)، گردئن رينل پيپليري سيل ڪارڪينوما (KIRP)، ۽ ڪولن ايڊينو ڪارڪينوما (COAD) (p value <0.05) (Fig. 1e) . جوڙيل صحتمند/تومور جي نمونن جي تجزيي وڌيڪ تصديق ڪئي ته DARS-AS1 جي هڪ خاص طور تي اعليٰ اظهار جي ٽومر ۾ مثاني urothelial carcinoma (BLCA)، گردئن رينل ڪليئر سيل ڪارڪينوما (KIRC)، پروسٽٽ adenocarcinoma (PRAD)، lung squamous cell carcinoma (LUSC) uterine corpus endometrial carcinoma (UCEC)، lung adenocarcinoma (LUAD)، جگر hepatocellular carcinoma (LIHC)، گردئن رينل پيپليري سيل ڪارڪينوما (KIRP)، ۽ ڪولن ايڊينو ڪارڪينوما (COAD) (p value <0.05) (Fig. 1e) .جوڙيل صحتمند/ٽيومر جي نمونن جو تجزيو پڻ DARS-AS1 جي مثاني urothelial carcinoma (BLCA)، صاف سيل رينل ۽ رينل سيل ڪارڪينوما (KIRC)، پروسٽٽ ايڊينو ڪارڪينوما (PRAD)، lung squamous cell carcinoma (LUSC) ٽيومر ۾ خاص طور تي اعليٰ اظهار جي تصديق ڪئي., карцинома эндометрия тела матки (UCEC), аденокарцинома легкого (LUAD), гепатоцеллюлярная карцинома печени (LIHC), папиллярно-клеточная карцинома почки (KIRP) и аденокарцинома толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e– m). , endometrial carcinoma of the corpus uteri (UCEC)، ڦڦڙن جو adenocarcinoma (LUAD)، جگر جو hepatocellular carcinoma (LIHC)، گردئن جو papillary cell carcinoma (KIRP)، ۽ colon جو adenocarcinoma (COAD) (p value < 0.05) (Fig. 1e-m) .配对 配对健康 / 的 进 进 进 进 进 进 进 进 进 (LUSC) 肿瘤 尿路 尿路 尿路 的 肿瘤 的显着 显着 更 高 高 高 高 (ucc)، 肺腺癌 肺腺癌 细胞癌 (ligc)، 肾 细胞癌 细胞癌 肾 细胞癌 (ڪيڊ (ڪوڊ) <0.05) (图1e-m) .配 配对 对 / / 细胞癌 的 的 的 证实 证实 证实(لوس) 内膜 内膜肿瘤) 肺腺癌 的的) 肝肝 的 细胞癌 肾 乳头状 乳头状 细胞 细胞 细胞 细胞 细胞癌 (kirp) (coad) (p 值<0.05) (图1e-m) .تجزيا صحتمند/ٽيومر جوڙيل نمونن جي وڌيڪ مدد ڪئي DARS-AS1 جي ڪردار ۾ مثاني urothelial carcinoma (BLCA)، صاف سيل رينل سيل ڪارڪينوما (KIRC)، پروسٽٽ ايڊينو ڪارڪينوما (PRAD)، ۽ ڦڦڙن جي اسڪواومس سيل ڪارڪينوما (LUSC) ٽامي.экспрессия при карциноме тела матки (UCEC), аденокарциноме легкого (LUAD), гепатоцеллюлярной карциноме (LIHC), почечно-почечной папиллярно-клеточной карциноме (KIRP) и аденокарциноме толстой кишки (COAD) (значение p <0,05) (рис. 1e -م). corpus uterine carcinoma (UCEC)، lung adenocarcinoma (LUAD)، hepatocellular carcinoma (LIHC)، renal papillary cell carcinoma (KIRP)، ۽ colon adenocarcinoma (COAD) (p value <0.05) (Figure 1e -m).گڏجي گڏ ڪيو ويو، اهي نتيجا ظاهر ڪن ٿا ته DARS-AS1 مختلف قسم جي ڪينسر ۾ وڏي پيماني تي ۽ انتهائي اظهار ڪيو ويو آهي.
ڇاڪاڻ ته DARS-AS1 ۽ DARS (جين انڪوڊنگ ڪندڙ اينٽي سينس اسٽرينڊ) هڪ ئي پروموٽر کي شيئر ڪن ٿا ۽ هڪ ٻئي جي ڀرسان واقع آهن، اسان shRNA کي خاص طور تي DARS-AS1 کي بند ڪرڻ لاءِ ٺاهيو آهي پر DARS نه (ضمني شڪل 2a،b ۽ ضمني جدول 2) .SW620 کان علاوه، اسان ٽي ٻيون سيل لائينون پڻ استعمال ڪيون آهن جيڪي DARS-AS1 کي انتهائي اظهار ڪندي shRNA knockdown جي افاديت ۽ ڪارڪردگي جي مطالعي لاءِ (ضمني جدول 3).اسان جا نتيجا ظاهر ڪن ٿا ته سڀني ٽن shRNAs ترقي ڪئي گهٽ ۾ گهٽ 80٪ DARS-AS1 knockdown ڪارڪردگي سان DARS mRNA جي مقدار تي ٿورو اثر ٿيو (ضمني شڪل 2c-f).ان کان علاوه، اسان ڏٺا ته DARS-AS1 knockdown هنن shRNAs سان خاص طور تي سيل جي واڌ کي روڪيو ڪولوريڪٽل ڪينسر سيل لائينون SW620 (49.7٪) ۽ HCT116 (27.7٪)، چھاتی جي ڪينسر جي سيل لائن MBA-MD-231 (53.4٪).) ۽ HepG2 هيپاٽوما سيل لائن (92.7٪ گهٽتائي)، انهي سان گڏ انهن جي غير ترتيب واري دائري ٺاهڻ جي صلاحيت (اوسط گهٽتائي ~ 50.8٪، 44.6٪، 40.7٪ ۽ 75.7٪ في سيل لائن) (Fig. 2a,b).SW620 ۾، ڪالوني ٺهڻ جي نتيجن جي نتيجي ۾ وڌيڪ تصديق ڪئي وئي ته DARS-AS1 shRNA خاص طور تي سيل جي واڌ کي روڪيو، تقريبن 69.6٪ جي اوسط گهٽتائي سان (تصوير 2c).
SW620، HCT116، MBA-MD-231، ۽ HepG2 سيلز تي ڪنٽرول shRNA ۽ DARS-AS1 shRNA جو اثر سيل پرولپريشن (a) ۽ اسپيرائڊ ٺهڻ (b) تي.c اثر ڪنٽرول shRNA ۽ DARS-AS1 shRNA تي ڪالوني ٺهڻ تي SW620 سيلز ۾.سيل جي پکيڙ (ڊي)، اسپيرائڊ ٺهڻ (اي)، ۽ ڪالوني ٺهڻ (f) SW620 سيلز جي اوور ايڪسپريسنگ DARS-AS1.ڏيکاريل ڊيٽا ٽن تجربن جو مطلب ± معياري انحراف آهي.* p ≤ 0.05، ** p ≤ 0.01، ۽ *** p ≤ 0.001 پاران ٻه-ٽيل شاگردن جي ٽي ٽيسٽ.
ڪم جي نقصان جي مطالعي کي مڪمل ڪرڻ لاء، اسان اڳتي وڌايو SW620 سيلز اوور ايڪسپريسنگ DARS-AS1 (ضمني تصوير. 2g).DARS-AS1 اوور ايڪسپريشن خاص طور تي سيل جي واڌ کي وڌايو (1.8-فولڊ)، اڻ ڳڻي اسفيرائڊ ٺهڻ (1.4-فولڊ)، ۽ ڪالوني ٺهڻ (3.3-گنا) SW620 سيلز ۾ (تصوير 2d-f).اسان هن نتيجي جي تصديق ڪئي ٻي DARS-AS1 ايڪسپريسنگ سيل لائن، A549 استعمال ڪندي.DARS-AS1 اوور ايڪسپريشن جي ڪري ھن وڌايل سيل جي واڌ کي وڌيڪ A549 سيلز ۾ ڏٺو ويو (ضمني تصوير. 2h، i ۽ ضمني جدول 3).گڏ ڪيو ويو، اهي فائدا ۽ نقصان جي مطالعي مان اهو ظاهر ٿئي ٿو ته DARS-AS1 ويٽرو ۾ سرطان جي سيل جي واڌاري کي وڌايو.
بنيادي ميڪانيزم کي ڳولڻ لاءِ جنهن جي ذريعي DARS-AS1 سيل جي واڌ کي منظم ڪري ٿو، اسان ان جي امڪاني پروٽين-بائنڊنگ ڀائيوارن کي سڃاڻڻ لاءِ آر اين اي پل-ڊائون تجزيو ڪيو.RT-qPCR نتيجن مان ظاهر ٿيو ته DARS-AS1 جو 86.2٪ SW620 سيلز جي سيٽوپلازم ۾ واقع آهي (ضمني شڪل 3a).ان ويٽرو ٽرانڪرائڊ ٿيل بايوٽينيليٽيڊ DARS-AS1 يا pseudoRNA پوءِ SW620 سيل ليسيٽس سان گڏ ڪيو ويو ۽ بعد ۾ SDS-PAGE علحدگيءَ سان.بعد ۾ چانديءَ جا داغ ڏيکاريا ويا ته هڪ الڳ بينڊ (~38 kDa) خاص طور تي DARS-AS1 پل جي نمونن ۾ بهتر ڪيو ويو پر ڊمي RNA يا موتي نموني ۾ نه (Fig. 3a).هن بينڊ جي سڃاڻپ هڪ PKR ايڪٽيويٽ پروٽين (PACT) جي طور تي ماس اسپيڪٽروميٽري (MS) ذريعي ڪئي وئي ۽ وڌيڪ تصديق ڪئي وئي SW620، HCT116، ۽ HepG2 سيل لائينز (Fig. 3a,b) ۾ امونوبلوٽنگ ذريعي.DARS ۽ لاڳاپيل PACT پروٽين جي افزودگي - PKR ۽ TRBP - پڻ تحقيق ڪئي وئي آر اين اي تجزيي پاران مغربي بلوٽنگ (WB).نتيجن مان ظاهر ٿيو ته DARS-AS1 RNA ۽ انهن ٽن پروٽينن جي وچ ۾ ڪوبه سڌو رابطو نه مليو (ضمني تصوير 3b).DARS-AS1 ۽ PACT جي وچ ۾ مخصوص رابطي جي وڌيڪ تصديق ڪئي وئي آر اين اي امونوپريسيپيٽيشن (RIP) تجزيي، جنهن مان ظاهر ٿيو ته DARS-AS1 خاص طور تي مخالف PACT اينٽي باڊيز ۾ افزودگي ڪئي وئي پر ٻيا ڪنٽرول آر اين ايز (شڪل 3c) نه.اهو طئي ڪرڻ لاءِ ته ڇا DARS-AS1 ڪنهن ٻئي سيلولر اجزاء جي غير موجودگيءَ ۾ PACT سان سڌو رابطو ڪري ٿو، هڪ ان ويٽرو بايوليئر انٽرفيروميٽري (BLI) پرکھ صاف ٿيل PACT استعمال ڪندي ڪيو ويو.بايوٽين-ليبل ٿيل DARS-AS1 يا ڊمي RNA streptavidin (SA) بايوسينسر تي متحرڪ ڪيو ويو ۽ پوءِ 1 μM PACT تي مشتمل ڪنيٽيڪ بفر ۾ انڪيوبيو ويو.خاص طور تي، PACT مضبوط طور تي DARS-AS1 (KD قدر ~ 26.9 nM) سان پابند آهي، پر آر اين اي کي نقل ڪرڻ لاء نه (شڪل 3d).گڏ ٿي ويا، اهي نتيجا DARS-AS1 ۽ PACT جي وچ ۾ سڌي رابطي ۽ اعلي لاڳاپي جو مظاهرو ڪن ٿا.
آر اين اي پل تجزيي جي سڃاڻپ ڪئي وئي DARS-AS1 SW620 سيلز ۾ PACT سان لهه وچڙ ۾.مٿي، لاڳاپيل پروٽين جي چانديء جو داغ.لوئر immunoblots مخالف PACT اينٽي باڊي سان انجام ڏنو ويو.b RNA پل-ڊائون تجزيو ڪيو ويو HCT116 (مٿي) ۽ HepG2 (هيٺ) سيلز ۾.PACT جي افزائش کي امونوبلوٽنگ ذريعي معلوم ڪيو ويو.cRNA immunoprecipitation (RIP) assays SW620 سيلز ۾ ڏيکاريل اينٽي باڊيز استعمال ڪندي ڪيا ويا.d PACT بائنڊنگ وکر مڪمل ڊگھائي DARS-AS1 يا ڪنٽرول آر اين اي کي بايوليئر انٽرفيروميٽري (BLI) استعمال ڪندي حاصل ڪيا ويا.آر اين اي اسٽريپٽاوڊين بائيو سينسر تي متحرڪ هئي.1 μM PACT انجمن کي ماپ ڪرڻ لاء استعمال ڪيو ويو.اي آر اين اي پل پرکھ بايوٽينيليٽيڊ مڪمل ڊگھائي DARS-AS1 استعمال ڪندي ڪئي وئي يا ڪٽيل (مٿي).Immunoblot ڏيکاريو PACT وصول ڪيو (هيٺ).f صاف ٿيل پرچم ٿيل PACT کي بايوٽينيليٽڊ مڪمل ڊگھائي DARS-AS1 سان لڳايو ويو يا ان ويٽرو RIP assay لاءِ (جيئن ته e ۾).ڪڍيل آر اين اي جي تصديق ڪئي وئي RT-qPCR پاران.g PACT لاءِ مختلف آر اين اي ٽڪڙن جو لاڳاپو لاڳاپو حاصل ڪيو ويو بايوليئر انٽرفيوميٽري استعمال ڪندي.تجزيو لاء، 100 nM RNA ۽ 1 μM RAST استعمال ڪيا ويا.h vitro RIP assays استعمال ڪيا ويا صاف ٿيل برقرار يا ڪٽيل ليبل ٿيل PACT استعمال ڪندي.ڪڍيل آر اين اي جي تصديق ڪئي وئي RT-qPCR پاران.i SW620 سيلز جي واڌ جي شرح اوور ايڪسپريسنگ DARS-AS1، PACT، يا ٻئي.j SW620 سيلز ۾ مڪمل ڊگھائي يا ڪٽيل DARS-AS1 جو اوور ايڪسپريشن سيل جي واڌ تي مختلف اثر پيو.k اپوپوٽوسس اينٽي PARP اينٽي باڊي سان امونوبلوٽنگ ذريعي معلوم ڪيو ويو.l DARS-AS1 جو ناڪ آئوٽ SW620 سيلز جي اپوپٽوسس کي متاثر ڪري ٿو جيئن فلو سائٽوميٽري ڏيکاريل آهي.ڏيکاريل ڊيٽا ٽن تجربن جو مطلب ± معياري انحراف آهي. *p ≤ 0.05، **p ≤ 0.01، ***p ≤ 0.001، ****p < 0.0001، ٻن طرفن واري شاگردن جي ٽي ٽيسٽ ذريعي. *p ≤ 0.05، **p ≤ 0.01، ***p ≤ 0.001، ****p < 0.0001، ٻن طرفن واري شاگردن جي ٽي ٽيسٽ ذريعي. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0.05، **p ≤ 0.01، ***p ≤ 0.001، ****p < 0.0001 پاران ٻه طرفي شاگردن جي ٽي ٽيسٽ. *p ≤ 0.05، **p ≤ 0.01، ***p ≤ 0.001، ****p <0.0001، 通过双尾学生t 检验. *p ≤ 0.05، **p ≤ 0.01، ***p ≤ 0.001، ****p <0.0001، 通过双尾学生t 检验. *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p <0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. *p ≤ 0.05، **p ≤ 0.01، ***p ≤ 0.001، ****p < 0.0001 پاران ٻه طرفي شاگردن جي ٽي ٽيسٽ.
اسان ان کان پوء ٽي بايوٽينيليٽ DARS-AS1 RNA ٽڪرا ٺاهيا آهن ويٽرو ٽرانسپشن ذريعي DARS-AS1 علائقي جي سڃاڻپ ڪرڻ لاءِ PACT ايسوسيئيشن لاءِ گهربل (شڪل 3e).آر اين اي جي تجزيي جا نتيجا ڏيکاريا ويا ته هر ٽڪرا PACT سان رابطو ڪرڻ جي قابل هو، پر 3′-ٽرمينل علائقو (384-768 نيوڪليوٽائڊس ليبل ٿيل A3) ڏيکاريا 1-384 نيوڪليوٽائيڊس کان وڌيڪ A1 ليبل ٿيل) (تصوير 3e).ساڳي نتيجا ڏٺا ويا in vitro RIP assay استعمال ڪندي recombinant PACT (Figure 3f).انهن نتيجن سان مطابقت، بي ايل آئي استعمال ڪندي PACT کي متحرڪ RNA ٽڪرا کي پابند ڪرڻ جا تجربا پڻ ڏيکاريا ويا آهن ته PACT A3 (384-768 nt) (KD قدر تقريباً 94.6 nM) لاءِ وڌيڪ لاڳاپو رکي ٿو، جڏهن ته ٻين علائقن سان لڳ ڀڳ ڪو به تعلق ناهي.(تصوير 3d).
اسان PACT ۾ لاڳاپيل پابند علائقن کي پڻ جانچيو.PACT ۾ ٽي فنڪشنل ڊومينز شامل آهن، جن مان ٻه محفوظ ٿيل آهن ڊبل-اسٽرينڊ آر اين اي-بائنڊنگ ڊومينز (dsRBD) ۽ ٽيون ڊومين (نامزد ٿيل D3) جيڪي پروٽين جي رابطي جي هڪ ايڪٽيوٽر طور ڪم ڪن ٿا.هر ڊومين جي lncRNA پابند ڪرڻ جي صلاحيت کي جانچڻ لاءِ، اسان ٽن ميوٽيشنز کي انجنيئر ڪيو جيڪي ٽن ڊومينز مان هر هڪ کي هٽائي ڇڏيو ۽ هڪ ان ويٽرو RIP assay ڪيو.اسان جا نتيجا ڏيکاريا ويا ته PACT جي ٽين ڊومين (D3) کي ختم ڪرڻ خاص طور تي DARS-AS1 سان ان جي رابطي کي گھٽائي ڇڏيو (0.11-fold جي ڀيٽ ۾ برقرار PACT جي مقابلي ۾) ٻين ٻن ميوٽيشنز (Fig. 3h) جي مقابلي ۾، اهو ظاهر ڪيو ويو ته ڇڏڻ. D3 جو DARS سان رابطو ڪيو.-AC1.گڏ ڪيل، انهن نتيجن جو مشورو ڏئي ٿو ته DARS-AS1 ۽ PACT جي وچ ۾ رابطي بنيادي طور تي DARS-AS1 جي 3′ آخر ۽ PACT جي D3 ڊومين ذريعي ٿي سگھي ٿي.
اسان نوٽ ڪيو ته DARS-AS1 PACT جي اظهار تي ڪو به اثر نه ڪيو ۽ PACT تي DARS-AS1 (ضمني تصوير. 3c) تي ڪو اثر نه ٿيو.اسان وري سيل جي واڌ تي PACT دستڪ جي اثر جو جائزو ورتو.DARS-AS1 جي ابتڙ، لاڳاپو سيلز 1.5-3 ڀيرا تيز ٿي ويا جڏهن PACT کي بند ڪيو ويو (ضمني تصوير. 3d).ڪالوني ٺهڻ جي امتحان جا نتيجا ظاهر ڪن ٿا ته سيلز پي اي سي ٽي (ضمني شڪل 3e) سان shRNA علاج کان پوءِ 2-3-گنا ڪالونيون ٺاهيا آهن.جانچڻ لاءِ ته ڇا DARS-AS1 PACT ذريعي سيل جي واڌ ويجهه کي منظم ڪري ٿو، اسان SW620 سيلز ٺاهيا آهن جيڪي PACT، DARS-AS1، يا ٻئي کي اوور ايڪسپريس ڪندي.PACT جي اوور ايڪسپريشن ڏيکاريل سيل جي واڌاري جي اهم نمائش (شڪل 3i).جڏهن ته DARS-AS1 اوور ايڪسپريشن في سي خاص طور تي سيل جي واڌ ويجهه کي وڌايو، DARS-AS1 ۽ PACT جي اوور ايڪسپريسنگ سيلز جي واڌ جي شرح ۾ ڪو خاص فرق نه هو.انهن نتيجن جو مشورو ڏنو ويو آهي ته PACT شايد DARS-AS1 اوور ايڪسپريشن جي سبب وڌندڙ واڌ کي منهن ڏئي سگهي ٿي.
جيئن ته DARS-AS1 جي مختلف علائقن ۾ مختلف PACT-بائننگ صلاحيتون آهن، اسان تحقيق ڪئي انهن جي لاڳاپا اثر سيل جي واڌ تي DARS-AS1 ٽڪرن جي مختلف اوور ايڪسپريشن ذريعي.ٻين ٻن ٽڪرن جي مقابلي ۾، DARS-AS1 3′ آخر (384-768 nt) تي اوور ايڪسپريس ڪيو ويو، DARS-AS1 ۾ PACT سان لاڳاپيل مکيه علائقو، جنهن ۾ سيل جي واڌ کي تيز ڪرڻ جي اعليٰ صلاحيت هئي (Fig. 3j).اهي نتيجا DARS-AS1 جي پابند گنجائش ۽ حياتياتي فنڪشن جي وچ ۾ مثبت لاڳاپا ظاهر ڪن ٿا.
PACT کي ٻڌايو ويو آهي پرو اپوپٽوٽڪ پروٽين 19.تنهن ڪري، اسان تحقيق ڪئي DARS-AS1 جو اثر apoptosis تي.جيئن توقع ڪئي وئي، DARS-AS1 knockdown خاص طور تي SW620 سيلز ۾ PARP صافي کي وڌايو ۽ SW620، HCT116، HepG2، ۽ MBA-MD-231 سيل لائنن ۾ اينڪسين وي-مثبت سيلز جو تناسب وڌايو (تصوير 3k).3).3f-h)، ظاهر ڪري ٿو ته DARS-AS1 جو مخالف اپوپٽوٽڪ اثر سرطان جي سيلن ۾ PACT جي اپوپٽوسس-انڊڪشن فنڪشن جي سامهون آهي.گڏجي گڏ ڪيو ويو، انهن نتيجن جو مشورو ڏئي ٿو ته DARS-AS1 oncogenic فنڪشن جو ميکانيزم PACT فنڪشن جي نمائش جي ذريعي ٿي سگهي ٿو.
اڳيون، اسان DARS-AS1-PACT ايسوسيئيشن جي فنڪشنل اثرات کي دريافت ڪيو.PACT کي ٻڌايو ويو آهي ته PKR کي سڌو رابطي ذريعي چالو ڪيو وڃي، جيڪو بعد ۾ eIF2α فاسفوريليشن کي وڌائيندو آهي، جنهن جي ڪري ترجمي واري خارج ٿيڻ ۽ apoptosis17.پهرين، اسان جانچيو ته ڇا DARS-AS1 PACT ۽ PKR جي سيلولر لوڪلائيزيشن کي متاثر ڪري ٿو.Confocal fluorescence microscopy ڏيکاريو ويو آهي ته PACT ۽ PKR SW620 سيلز ۾ 0.72 جي اوسط پيئرسن جي رابطي جي کوٽائي سان گڏ تمام گهڻو گڏيل هئا.ان کان علاوه، DARS-AS1 اوور ايڪسپريس خاص طور تي گھٽجي ويو PACT ۽ PKR ڪو-لوڪائيزيشن (مطلب پيئرسن جي رابطي جي کوٽائي 0.61) (شڪل 4a).تحقيق ڪرڻ لاءِ ته ڇا DARS-AS1 PACT-PKR تعامل کي ماڊل ڪري سگهي ٿو، اسان SW620 سيل ليسيٽس ۾ مخالف PACT اينٽي باڊي سان ڪو-امونوپريسيپيٽيشن (co-IP) پرکھ ڪيو.PKR ڪنٽرول سيلز ۾ مخالف PACT ۾ انتهائي تيز ٿي وئي هئي، جڏهن ته PKR وصولي خاص طور تي DARS-AS1 (Fig. 4b) کي ختم ڪرڻ واري سيلز مان lysates ۾ گھٽجي وئي هئي.صاف ٿيل ليبل ٿيل PACT ۽ PKR استعمال ڪيا ويا ويٽرو پروٽين بائنڊنگ اسيسز ۾.ان جي مطابق، جيڪي DARS-AS1 مهيا ڪيا پر ڪو به ڪنٽرول آر اين اي نه ڏيکاريو PACT-PKR رابطي کي دٻايو ويو (شڪل 4c).سڀئي نتيجا ڏيکاريا ويا ته DARS-AS1 PACT ۽ PKR رابطي کي ٽوڙي ڇڏيو.
ڪنٽرول سيلز ۾ PACT ۽ PKR جي گڏيل لوڪلائيزيشن يا DARS-AS1 جي اوور ايڪسپريسنگ سيلز کي confocal fluorescence microscopy استعمال ڪندي ڏٺو ويو.نيوڪليس DAPI سان داغ ٿيل هئا.شمارياتي نتيجا 16 تصويرن مان حاصل ڪيا ويا.b Co-immunoprecipitation (co-IP) اينٽي PACT اينٽي باڊي استعمال ڪندي سيل ليسيٽس آف ڪنٽرول SW620 سيلز ۾ يا سيلز جي اوور ايڪسپريسنگ DARS-AS1.سي ليبل ٿيل PACT، PKR کي صاف ڪيو ويو ۽ DARS-AS1 سان ويٽرو ۾ نقل ڪيو ويو يا ٺٺوليون آر اين اي ان ويٽرو پروٽين بائنڊنگ تجزيو لاء تيار ڪيا ويا.اينٽي فليگ اينٽي باڊيز استعمال ڪيا ويا مدافعتي عمل لاءِ.d اشارو ٿيل اينٽي باڊيز سان اميونبلٽس SW620 ۽ HCT116 سيلز ۾ ڪيا ويا ڪنٽرول shRNA يا DARS-AS1-shRNA سان منتقل ڪيا ويا جنهن جي پٺيان سيرم بکيو.e DARS-AS1 ايڪسپريس ليولز تبديل ٿيل سيلولر حساسيت کي ٿپسيگرين.SW620 سيلز DARS-AS1 shRNA، DARS-AS1 اوور ايڪسپريس پلازميڊ يا ڪنٽرول پلازمڊ سان منتقل ڪيا ويا.سيلز کي 48 ڪلاڪن تائين ٿپسيگرين سان علاج ڪيو ويو ۽ سيل جي استحڪام کي MTS ريگينٽ استعمال ڪندي طئي ڪيو ويو.f ويٽرو ۾ نقل ٿيل DARS-AS1 يا ڊمي آر اين اي ۽ صاف ٿيل PACT استعمال ڪيا ويا ان ويٽرو ايڪٽيويشن امتحان ۽ اميونو بلوٽ جي چڪاس لاءِ.g انهن اينٽي باڊيز کي استعمال ڪندي اميونوبلٽس SW620-ctrl سيلز (بائیں) يا PKR ميوٽنٽ (ساڄي) کي اوور ايڪسپريس ڪندڙ سيلز تي ڪيا ويا.انهن سيلن کي پوءِ ڪنٽرول shRNA يا DARS-AS1-shRNA سان تبديل ڪيو ويو جنهن جي پٺيان سيرم ستو پيو.h فلو cytometry ڏيکاريو ويو آهي ته غير فعال ٿيڻ ميوٽيٽ PKR SW620 سيلز ۾ DARS-AS1-Induced apoptosis لاءِ معاوضو ڏنو.i اشارو ٿيل اينٽي باڊيز سان Immunoblots SW620 (بائیں) يا HCT116 (ساڄي) سيلز ۾ ڪيا ويا.ڪنٽرول shRNA يا DARS-AS1 shRNA سان منتقل ٿيل سيلز سيرم کان محروم آهن ۽ 100 nM PKR C16 inhibitor يا DMSO سان گڏ آهن.اسڪيل بار = 5 µm.ڏيکاريل ڊيٽا ٽن تجربن جو مطلب ± معياري انحراف آهي.* p ≤ 0.05 ٻه-ٽيل شاگردن جي ٽي-ٽيسٽ.
اهو عام طور تي مڃيو وڃي ٿو ته هڪ ڀيرو PACT PKR17 سان رابطو ڪري ٿو، Thr451 تي PKR فاسفوريليشن ٿي سگهي ٿو.اسان جا نتيجا ظاهر ڪن ٿا ته PKR فاسفوريليشن جي سطح خاص طور تي DARS-AS1 knockdown سيلز ۾ سيرم ستو ٿيڻ کان پوءِ وڌي وئي هئي (Fig. 4d ۽ Supplementary Fig. 4a).ان جي مطابق، اسان ڏٺو ته eIF2α جي فاسفوريليشن، مکيه PKR سبسٽٽ، پڻ خاص طور تي DARS-AS1 shRNA (Fig. 4d ۽ ضمني تصوير. 4a) پاران وڌي وئي هئي.Thapsigargin هڪ ER اسٽريسر آهي جيڪو ER کي Ca2+ ڇڏڻ جو سبب بڻائيندو آهي.thapsigargin سان علاج PACT جي اظهار ۽ چالو ڪرڻ لاءِ ٻڌايو ويو آهي، جيڪو PKR سان وڌيڪ لاڳاپو ۽ چالو ڪري ٿو، eIF2α فاسفوريليشن 18,61 کي وڌائڻ سان apoptosis جي ڪري.هتي، اسان thapsigargin استعمال ڪيو PACT/PKR رستي جي محرڪ جي طور تي تحقيق ڪرڻ لاءِ ته ڇا DARS-AS1 سيلز کي PACT/PKR رستي کي روڪيندي دٻاءُ تي قابو پائڻ ۾ مدد ڪري سگهي ٿو.اسان ڏٺو آهي ته DARS-AS1 اظهار جي سطح مثبت طور تي ٿپسيگرين جي سيل جي مزاحمت سان لاڳاپيل آهي.SW620 سيلز DARS-AS1 جي اوور ايڪسپريسنگ کي بهتر طور تي بچي ويا جڏهن ٿپسيگارين سان علاج ڪيو ويو، جڏهن ته DARS-AS1 جي دستڪ سان سيلز وڌيڪ حساس ٿي ويا (تصوير 4e).انهن نتيجن سان لاڳيتو، DARS-AS1 اوور ايڪسپريشن گهٽجي ويو ٿپسيگارگين-حوصله افزائي PKR فاسفوريليشن (ضمني تصوير. 4b).ان جي ابتڙ، thapsigargin جي علاج کان پوء، PKR ۽ eIF2α فاسفوريليٽ ڪيو ويو DARS-AS1 دستڪ ڊائون سيلز ۾ ڪنٽرول سيلز جي مقابلي ۾ (ضمني تصوير. 4b).دلچسپ ڳالهه اها آهي ته، thapsigargin induced DARS-AS1 اظهار هڪ دوز-انحصار انداز ۾، جيڪو ظاهر ڪري سگھي ٿو DARS-AS1 (ضمني تصوير. 4c) جي مخالف دٻاءُ واري فنڪشن.ان کان علاوه، اسان انهن مشاهدن جي تصديق ڪرڻ لاء ويٽرو ايڪٽيويشن اسيس ۾ انجام ڏنو.مختصر طور تي، PKR هڪ اينٽي PKR اينٽي باڊي استعمال ڪندي سيل ليسيٽس کان پاڪ ڪيو ويو، پوءِ ويٽرو ۾ نقل ٿيل ريٽيڪل PACT ۽ DARS-AS1 سان گڏ ڪيو ويو.اينزيميٽڪ ردعمل کان پوء، فاسفو-PKR WB استعمال ڪندي معلوم ڪيو ويو.اسان جا نتيجا ظاهر ڪن ٿا ته PKR فاسفوريليشن خاص طور تي DARS-AS1 پاران روڪيو ويو، پر ڪنٽرول آر اين اي (شڪل 4f) طرفان نه.اهي vitro ۽ vivo ۾ نتيجن جو مشورو ڏئي ٿو ته DARS-AS1 PACT-ثالث PKR چالو کي روڪي ٿو.ساڳئي وقت، اسان DARS-AS1 (شڪل 4f) جي موجودگي ۾ PACT وصولي ۾ گهٽتائي پڻ ڏٺو.اهو نتيجو ويٽرو پروٽين بائنڊنگ پرس جي نتيجن سان مطابقت رکي ٿو (شڪل 4c) ۽ ٻيهر PACT-PKR ايسوسيئيشن لاءِ DARS-AS1 جي بلاڪنگ فنڪشن کي بيان ڪري ٿو.
PACT جي D3 ڊومين ۾ Ser246 ۽ Ser287 سيلولر دٻاء هيٺ PKR چالو ڪرڻ جي ضرورت آهي.الانائن لاءِ ٻن سرين جي باقيات جي متبادل ڏني وئي ميوٽيٽ PACT (mutD)، جنهن PKR کي دٻاءُ جي غير موجودگيءَ ۾ چالو ڪيو، ۽ الانائن (mutA) جي متبادل پروٽوڪول کي رد ڪري ڇڏيو.جيئن ته اسان DARS-AS1 سان سڌي وابستگي ۾ هن ڊومين جي اهميت کي ظاهر ڪيو آهي، اسان انهن ٻن PACT ميوٽنٽ کي ٽيسٽ ڪرڻ لاء تيار ڪيو آهي ته ڇا اهي باقي بچيل DARS-AS1 سان رابطي ۾ شامل ٿي سگهن ٿيون.دلچسپ ڳالهه اها آهي ته، ٻنهي ميوٽيٽنس DARS-AS1 (ضمني شڪل 4d) کي پابند ڪرڻ جي صلاحيت وڃائي ڇڏيو، اهو مشورو ڏئي ٿو ته PACT پروٽين جي مڪمل جوڙجڪ DARS-AS1 سان موثر رابطي لاء گهربل هجي.
ان کان علاوه، اسان جا نتيجا پڻ پيش ڪن ٿا ته DARS-AS1-shRNA-حوالو سيل جي ڦهلائڻ جي حوصلا افزائي طور تي غالب منفي PACT ميوٽنٽ (PACTmutA) يا غالب منفي PKR ميوٽنٽ (PKRmut) (ضمني تصوير 4e. e) کي ختم ڪندي جزوي طور تي بحال ڪري سگھجي ٿو.غالب-منفي PKR ميوٽنٽ جي اوور ايڪسپريشن PKR فاسفوريليشن کي گهٽائي ڇڏيو DARS-AS1 دستڪ ڊائون سان گڏو گڏ eIF2α فاسفوريليشن سيرم کان محروم سيلز ۾ (Fig. 4g).وڌيڪ اهم طور تي، DARS-AS1 knockdown پاران متاثر ٿيل اپوپٽوٽڪ سيلز جو تناسب PKRmut (تصوير 4h ۽ ضمني تصوير. 4g) جي اوور ايڪسپريسنگ سيلز ۾ پڻ گھٽجي ويو.PKR kinase سرگرمي جي روڪٿام پڻ DARS-AS1 فنڪشن کي متاثر ڪري ٿي، جيئن نتيجن مان ظاهر ٿئي ٿو ته DARS-AS1 دستڪ ڊائون گهٽ ۾ گهٽ PKR ۽ eIF2α فاسفوريليشن کي شروع ڪيو جڏهن سيلز کي PKR-مخصوص C16 انابيٽر سان علاج ڪيو ويو (تصوير 4i ۽ ضمني تصوير 4).).گڏجي گڏ ڪيو ويو، اسان جا نتيجا پيش ڪن ٿا ته DARS-AS1 سيل جي واڌاري کي وڌايو، گهٽ ۾ گهٽ جزوي طور تي، PACT-ثالث PKR چالو ڪرڻ کي روڪيندي.
tumorigenesis ۾ DARS-AS1 جي ڪردار کي وڌيڪ ڳولڻ لاءِ، اسان مائوس xenograft ماڊل استعمال ڪندي وييو تجربن ۾ انجام ڏنو. نتيجن مان ظاهر ٿئي ٿو ته DARS-AS1 جي دٻائڻ ۾ ڊرامائي طور تي چوٿون (p value <0.0001) (Fig. 5a) ۾ ٽامي جي واڌ ۾ گهٽتائي ٿي. نتيجن مان ظاهر ٿئي ٿو ته DARS-AS1 جي دٻائڻ ۾ ڊرامائي طور تي چوٿون (p value <0.0001) (Fig. 5a) ۾ ٽامي جي واڌ ۾ گهٽتائي ٿي. Результаты показывают, что нокдаун DARS-AS1 резко снижает рост опухоли у мышей (значение p <0,0001) (рис. 5а). نتيجن مان ظاهر ٿئي ٿو ته DARS-AS1 knockdown انتهائي تيزيءَ سان چوٿون ۾ طومار جي واڌ کي گھٽائي ٿو (p value <0.0001) (Figure 5a).结果表明، DARS-AS1结果表明،DARS-AS1 的敲低显着降低了小鼠的肿瘤生长（p值<0.0001）（图5a）. Результаты показали, что нокдаун DARS-AS1 значительно снижает рост опухоли у мышей (значение р <0,0001) (RIS. 5а). نتيجن مان ظاهر ٿيو ته DARS-AS1 knockdown خاص طور تي چوٿون (p value <0.0001) (Figure 5a) ۾ ٽامي جي واڌ کي گھٽائي ڇڏيو.اهڙيءَ طرح، DARS-AS1 knockdown گروپ ۾، اٽڪل 72.9٪ جي وچ ۾ ٽومر جي مقدار ۾ هڪ اهم گهٽتائي هئي ۽ اٽڪل 87.8٪ (Figure 5b-d) ذريعي ٽامي ڪاميٽي جو مطلب آهي.انهن نتيجن کي سختي سان مشورو ڏنو ويو آهي ته DARS-AS1 خاص طور تي وييو ۾ طومار جي واڌ کي فروغ ڏئي سگهي ٿو.
DARS-AS1 نوڪ ڊائون جو اثر ڪولوريڪٽل آنڪوجنسي تي ننگي چوٿين ۾.واڌ وکر (a)، ٽامي جي ماپ (b)، وزن (c)، ۽ ٽيمر تصويرون (d) ڏيکاريا ويا آهن.نقص بار ± SEM جي نمائندگي ڪن ٿا. n = 10. ****p <0.0001، ٻن طرفن واري شاگردن جي ٽي ٽيسٽ ذريعي. n = 10. ****p <0.0001، ٻن طرفن واري شاگردن جي ٽي ٽيسٽ ذريعي. n = 10. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию Стьюдента. n = 10. ****p < 0.0001 ٻه طرفي شاگردن جي ٽي-ٽيسٽ.ن = 10. ****p <0.0001، 通过双尾学生t 检验. ****p <0.0001، 通过双尾学生t检验. ****p < 0,0001 по двустороннему критерию стьюдента. ****p <0.0001 ٻه-ٽيل شاگردن جي ٽي-ٽيسٽ.e Kaplan-Meier DARS-AS1 اظهار جي سطح جي وچ ۾ رابطي جو تجزيو ڪيو ۽ مريضن ۾ مجموعي بقا UVM، KICH، KIRP، MESO، GBM، ۽ LGG.مريضن ۾ DARS-AS1 اظهار جي اعلي سطح مٿين 50٪ ۾ هئا.مريضن ۾ DARS-AS1 اظهار جي گھٽ سطح هيٺان 50٪ ۾ هئي.p-values ​​مقرر ڪيا ويا لاگ رينڪ ٽيسٽ استعمال ڪندي.f تجويز ڪيل ماڊل جنهن ۾ DARS-AS1 PACT-PKR رستي ۽ طومار جي واڌ کي منظم ڪري ٿو.
DARS-AS1 جي ڪلينڪل اثر کي بهتر سمجهڻ لاء، اسان ان جي اظهار ۽ مريض جي بقا جي وچ ۾ رابطي جي جانچ ڪئي.TCGA ڊيٽا سيٽ جي تجزيي ڪندي، اسان ڏٺو ته اعلي DARS-AS1 اظهار سان لاڳاپيل هو uveal melanoma (UVM)، رينل ڪروموفوبيا (KICH)، رينل پيپلري سيل ڪارڪينوما (KIRP)، ميسوٿيليوما (MESO)، ملٽي پلڪس.لوئر بقا خاص طور تي glioblastoma morphosis (GBM) سان لاڳاپيل هو ۽ مريضن سان گهٽ گريڊ دماغ گليوما (LGG) (شڪل 5e).انهن نتيجن جو مشورو ڏنو ويو آهي ته DARS-AS1 ڪلينڪ ٽيومر جي ترقي ۾ اهم ڪردار ادا ڪري سگهي ٿي ۽ ڪيترن ئي ڪينسر ۾ هڪ امڪاني اڳڪٿي ڪندڙ بايو مارڪر ٿي سگهي ٿي.
هن مطالعي ۾، وڏي پيماني تي CRISPRi فنڪشنل اسڪريننگ استعمال ڪندي، اسان اهو طئي ڪيو آهي ته DARS-AS1 lncRNA ٻن اهم دٻاء جي جواب ڏيڻ وارن، PACT ۽ PKR کي منظم ڪندي سرطان جي سيل جي دٻاء کي ختم ڪري ٿو.PACT سان سڌو رابطو ڪندي، DARS-AS1 PACT-ثالث PKR چالو کي روڪيو، ان ڪري اپوپٽوٽڪ سيل جي موت کي روڪڻ ۽ سيل جي واڌ کي وڌائڻ (Fig. 5f).DARS-AS1 جي اپ گريجوئيشن ڪيترن ئي قسمن جي ڪينسر ۾ مشاهدو ڪيو ويو آهي، اهو مشورو ڏئي ٿو ته ان جي ڪارڪردگي کي وڌائڻ جي سرطان جي سيل جي بقا کي دٻاء واري حالتن ۾ وسيع طور تي ڪيترن ئي قسمن جي سرطان تي لاڳو ٿئي ٿي.
PACT هڪ PKR ايڪٽيويٽ پروٽين جي طور تي سڃاڻپ ڪئي وئي آهي، ۽ PACT-ثالث PKR ايڪٽيويشن ٽرانسپشن، ترجمي، اپوپٽوسس، ۽ ٻين اهم سيلولر پروسيس62 کي منظم ڪندي دٻاء جي جوابن ۾ اهم ڪردار ادا ڪري ٿو.ڏهاڪن تائين، PACT-PKR cascade جي ڪينسر جي مخصوص ضابطي کي سمجهڻ جي ڪوشش ڪئي وئي آهي.هتي، اسان جي مطالعي مان ظاهر ڪيو ويو آهي PACT-PKR جي ضابطي جو هڪ مختلف ميکانيزم ڪينسر جي سيلن ۾ سيلولر lncRNA DARS-AS1 ذريعي، جيڪو سڌو سنئون PACT سان ڳنڍيل آهي، PACT-PKR رابطي کي بلاڪ ڪري ٿو، PKR چالو ڪرڻ ۽ eIF2α فاسفوريليشن کي روڪي ٿو، انهي سان گڏ دٻاء-حوصلہ افزائي اپوپيسس کي روڪي ٿو. آخرڪار ڪينسر جي پکيڙ کي متحرڪ ڪرڻ.سيلز.هي دريافت ڪينسر جي تشخيص ۽ علاج لاءِ امڪاني lncRNA مقصدن تي روشني وجهي ٿي.
اسان جي ڊيٽا ڏيکاري ٿي ته DARS-AS1 knockdown سيلز کي حساس ڪري ٿو سيرم فاقو ڪرڻ لاءِ فاسفوريليٽ PKR ۽ eIF2α ۾ اهم اضافو سان.انهن نتيجن جو مشورو ڏنو ويو آهي ته DARS-AS1 PACT / PKR سرگرمي کي روڪڻ سان سخت حالتن ۾ سرطان جي سيل جي بقا کي وڌايو.ٻيا ڪيترائي غير ڪوڊنگ RNAs، جهڙوڪ ASPACT ۽ nc886، PACT/PKR محور ۾ PACT48 mRNA کي گھٽائڻ يا PKR49,50,64 کي پابند ڪندي آٽو فاسفوريليشن کي ريگيوليشن ڪندي پڻ شامل آهن.انهن مان، DARS-AS1 PACT-PKR ايسوسيئيشن جي خرابي جي طور تي ڪم ڪري ٿو.هي مطالعو PACT/PKR محور جي ضابطي ۽ دٻاءُ جي جوابن ۾ lncRNAs جي ڪردار جي اسان جي سمجھ کي بهتر بڻائي ٿو.
PACT ۾ ٽي الڳ ڊومين شامل آهن.پهرين ٻن dsRBDs مان هر هڪ PACT جي PKR جي اعليٰ لاڳاپي جي پابند حاصل ڪرڻ لاءِ ڪافي آهي، جڏهن ته ٽيون ڊومين (D3) Vitro ۽ vivo ۾ PKR چالو ڪرڻ لاءِ گهربل آهي.اسان جي مطالعي مان معلوم ٿئي ٿو ته DARS-AS1 ترجيحي طور تي D3 ڊومين سان تعلق رکي ٿو (Fig. 3h).lncRNA (768 nucleotides) جي وڏي سائيز کي ڏنو ويو، DARS-AS1 D3 کي پابند ڪرڻ جسماني طور تي dsRBD ۽ PKR جي PACT ڊومين جي وچ ۾ رابطي کي روڪي سگھي ٿو، ان ڪري PACT ۽ PKR جي ايسوسيئيشن کي بلاڪ ڪري ٿو.PACT پوائنٽ ميوٽيشنز جيڪي Ser246 ۽ Ser287 کي D3 ۾ تبديل ڪيو الانائن يا اسپارٽٽ سان ان جي پابند لاڳاپي کي DARS-AS1 لاءِ متاثر ڪيو، D3 جي مجموعي ساختماني ۽ برقي ملڪيت جي اهميت ڏانهن اشارو ڪندي انهن جي انجمن ۾.مستقبل ۾ هن ميڪانيزم جي وڌيڪ تفصيلن جي ضرورت پوندي، وڌيڪ صحيح بايو ڪيميڪل تجزيو ۽ اعلي ريزوليوشن PACT ساخت جي تجزيو استعمال ڪندي.
اڳوڻي اڀياس ٻڌايو آهي ته DARS-AS1 ڪيترن ئي ميڪانيزم جي ذريعي سيل جي واڌ کي وڌايو 51,52,53.ھڪڙي مثال ۾، تحقيق ڪندڙن ڏٺو آھي ته DARS-AS1 پنھنجي اينٽيسينس پروٽين-انڪوڊنگ DARS جين کي ھدف ڪندي miP-194-5p کي گردئن جي ڪينسر جي سيلن ۾ ھدف ڪري ڇڏيو.بهرحال، موجوده مطالعي ۾، DARS-AS1 knockdown ڪيترن ئي قسمن جي ڪينسر ۾ DARS ٽرانسپشن تي ٿورو اثر پيو، جنهن ۾ گهٽ ۾ گهٽ کولوريڪل، سينو، ۽ جگر جي ڪينسر شامل آهن.ڇاڪاڻ ته lncRNAs سيل- ۽ ٽشو-مخصوص اظهار جي نمونن جي نمائش ڪن ٿا، فنڪشنل ميڪانيزم شايد سرطان جي قسمن ۾ محفوظ نه ٿي سگھن ٿيون، جيڪي اسان جي مشاهدن ۽ مختلف ڪينسر جي پوئين جائزي جي وچ ۾ هن تفاوت ۾ مدد ڪري سگھن ٿيون.مختلف جسماني ۽ نفسياتي عملن جي مخصوص ميڪانيزم کي واضح ڪرڻ لاء خاص مطالعي جي ضرورت آهي.
ڪلينڪل ڊيٽا جو تجزيو ڏيکاريو ويو آهي ته DARS-AS1 جو اظهار tumors ۾ سرطان جي مريضن جي بقا سان لاڳاپو رکي ٿو، جيڪو سرطان جي تشخيص ۾ DARS-AS1/PACT/PKR محور جي اهميت کي بيان ڪري ٿو.نتيجي ۾، اسان جي مطالعي مان اهو ظاهر ٿئي ٿو ته DARS-AS1 PACT / PKR سگنلنگ محور جو هڪ ريگيوليٽر آهي، سرطان جي سيل جي واڌ کي وڌائيندو آهي، ۽ دٻاء جي ردعمل دوران apoptosis کي روڪيندو آهي، جيڪو تحقيق جي هڪ ٻي لائين مهيا ڪري ٿو ۽ مستقبل جي تحقيق لاء امڪاني علاج ۾ دلچسپي رکي ٿو. .
انساني سيل لائينون SW620، A549، MBA-MD-231، HCT116، HepG2 ۽ HEK293T چين ۾ نيشنل سيل لائين ريسورس انفراسٽرڪچر مان حاصل ڪيا ويا.سڀئي سيلز DMEM وچولي ۾ برقرار رکيا ويا (DMEM، Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) 10% FBS (Gemini, Brooklyn, NY) ۽ 1% penicillin-streptomycin (Thermo Fisher Scientific) 37 ° C، 5% CO2 سان گڏ.انڪيوبيٽر
مخالف PACT، Abcam (ab31967)؛مخالف PKR, Abcam (ab184257);مخالف PKR (phospho-T451)، Abcam (ab81303)؛مخالف پرچم، Abcam (ab125243)؛مخالف eIF2α، Abcam (A0764)) ؛مخالف eIF2α (فاسفورس S51)، Abcam (ab32157)؛مخالف PACT (فاسفورس S246)، Abgent (AP7744b)؛مخالف β-ٽيوبولين، CST (2128)؛عام مائوس IgG، CST (5415S)؛عام خرگوش IgG، CST (2729S).اينٽي باڊيز کي 1:1000 PBST ۾ ويسٽرن بلٽنگ لاءِ ۽ 1:100 IP لاءِ گھٽايو ويو.
sgRNAs CRISPR-ERA66 نالي عوامي طور تي دستياب اوزار استعمال ڪندي ترقي ڪئي وئي.اسان sgRNA ڊولپمينٽ لاءِ ڊفالٽ ٽول پيراميٽر استعمال ڪيو ۽ 3 kb علائقي ۾ sgRNA بائنڊنگ سائيٽن جي ترتيب ڏنل الگورتھم.TSS تي مرڪز.sgRNA oligonucleotides جا تلاءُ CustomArray, Inc. (Bothewell, WA) ۾ ٺھيل ھئا ۽ انساني پيجي آر اين اي پلاسميڊس (Addgene #44248) ۾ ڪلون ڪيا ويا.مجموعي طور تي 12 µg پول ٿيل انسانيت وارو pgRNA پلاسميڊ، 7.2 µg جو psPAX2 (Addgene #12260)، ۽ 4.8 µg of pMD2.G (Addgene #12259) کي 5 x 106 HEK106 HEK106 HEK106 سي ايم اين اي سي ايم اين اي سي ايم اين اي سي ايم اين اي سي ايم اين اي سي ايم اين اي سي ايم اين اي سي ايم اين اي سي جي ڊسڪشن ۾ استعمال ڪيو ويو. سيلز (CWBIO، بيجنگ، چين) ٺاهيندڙن جي هدايتن تي عمل ڪندي.وائرس تي مشتمل سپرنٽنٽس گڏ ڪيا ويا 48 ۽ 72 ڪلاڪ منتقلي کان پوءِ ۽ 0.45 µm فلٽر ذريعي فلٽر ڪيا ويا.اسڪريننگ لاءِ، SW620 سيلز جيڪي dCas9/KRAB فيوزن پروٽين کي ظاهر ڪن ٿا، وائرس جي منتقلي ذريعي حاصل ڪيا ويا.تبديل ٿيل SW620 سيلز 0.1-0.3 جي MOI تي چار آزاد انفيڪشن تجربن ۾ وائرس لائبريري سان متاثر ٿيا ۽ 2 ڏينهن لاءِ 2 μg/ml puromycin (Sigma, St. Louis, MO) سان نموني ڪيا ويا.ان کان پوء، سيلز کي 18 ڏينهن تائين ويٽرو ۾ ڪلچر ڪيو ويو گهٽ ۾ گهٽ لائبريري ڪوريج 500 سيلز / sgRNA اسڪريننگ لاء.
جينوميڪ ڊي اين اي ڪڍيو ويو QIAamp DNA بلڊ ميڊي کٽ جي هدايتن جي مطابق (QIAGEN، Düsseldorf، Germany؛ 51183).مجموعي طور تي، 100 μg جينومڪ ڊي اين اي في حياتياتي ورجائي لائبريري کي تعمير ڪرڻ لاء استعمال ڪيو ويو.sgRNA علائقي کي پي سي آر جي ٻن دورن سان وڌايو ويو ۽ بارڪوڊ سان ڳنڍيو ويو.
پي سي آر پروڊڪٽس کي نيوڪليو اسپن® جيل ۽ پي سي آر پيوريفڪيشن ڪٽ (MACHEREY-NAGEL, Düren, Germany; 740609.250) استعمال ڪندي صاف ڪيو ويو ۽ Qubit™ HS ڊبل اسٽرينڊ ڊي اين اي ڊيٽشن ڪٽ (Thermo Fisher Scientific; Q32854) استعمال ڪندي مقدار کي صاف ڪيو ويو.
MTS جو اندازو سيل جي پيداوار کي ماپڻ لاء استعمال ڪيو ويو.سيلز کي 96-سٺي پليٽن ۾ 2000 سيلز / کوھ جي شروعاتي کثافت تي ٻج ڪيو ويو.سيلز جو لاڳاپو تعداد 4-6 ڏينهن جي مجموعي طور تي ظاهر ڪيل وقت تي روزانو ماپ ڪيو ويو.هر هڪ کوهه لاءِ، 20 μl MTS reagent (Promega) کي 100 μl DMEM سان ملايو ويو، 37 ° C تي 4 h لاءِ سيلن سان لڳايو ويو، ۽ پوءِ OD490 ماپيو ويو.
اڻڄاتل واڌ جي گنجائش کي دريافت ڪيو ويو گولن جي ٺهڻ جو تجزيو ڪندي.مختصر طور تي، shRNA DARS-AS1 يا ڪنٽرول shRNA سان منتقل ٿيل 2000 سيلز کي الٽرا لو اٽيچمينٽ مائڪرو پليٽس (ڪارننگ) ۾ ڪلچر ڪيو ويو وچولي تبديلي سان هر 4 ڏينهن.گولا 14 ڏينهن کان پوء ڳڻيا ويا.DARS-AS1 overexpression plasmid سان منتقل ٿيل 500 سيلز يا ڪنٽرول پلاسميڊ استعمال ڪيا ويا واڌارن جي امتحان لاءِ، ٻي صورت ۾ اهو طريقو تبديل نه ڪيو ويو.
RNA نقل ڪيو ويو T7 RNA پوليمريز ۽ بايوٽين-16-UTP (Roche 1138908910) Riboprobe® Combination Systems (Promega P1440) جي هدايتن مطابق.هتي استعمال ٿيل پرائمر ضمني جدول 4 ۾ ڏنل آهن.
پروٽين-ڪوڊنگ PACT يا PKR علائقن کي pET15b (Addgene #73619) ۾ ڪلون ڪيو ويو ۽ BL21 (DE3) ۾ تبديل ڪيو ويو.بيڪٽيريا رات جو ايل بي ۾ پکڙيل هئا جيڪي ايمپيسيلين سان فراهم ڪيا ويا ۽ پوءِ تازو ايل بي سان 100-گنا ملائي ويا.جڏهن وچولي جو OD600 0.8 تي پهچي ويو، 1 ايم ايم IPTG شامل ڪيو ويو پروٽين جي اظهار کي وڌائڻ لاء.انڪيوبيشن کان پوءِ رات جو نرمي سان ڇڪڻ سان (250 rpm 20 ° C تي)، سيل پيلٽ گڏ ڪيو ويو سينٽرفيوگريشن (4000 rpm، 10 منٽ، 4 ° سي).سيل پيليٽ کي ليسس بفر (50 ايم ايم ٽريس، پي ايڇ 8.0، 250 ايم ايم NaCl، 1 ايم ايم پي ايم ايس ايف) ۾ ٻيهر بحال ڪريو ۽ برف تي 30 منٽ لاءِ انڪيبيٽ ڪريو، پوءِ سونيڪٽ (15 منٽ، 5 ايس آن/آف، برف تي) ۽ سينٽريفيوج (1300، 1300) آر پي ايم).، 30 منٽ، 4°С).ان کان پوءِ سپرنيٽنٽ کي 3 ڀيرا Ni-NTA resin (QIAGEN) تي 4 ڊگري سينٽي گريڊ تي ڌويو ويو، 4 ڀيرا واش بفر سان ڌويو ويو (50 ايم ايم ٽريس، پي ايڇ 8.0، 40 ايم ايم اميڊازول، 250 ايم ايم NaCl) ۽ مجموعي طور تي 3 ڀيرا ڌوئي ويو. 10 ml eluent buffer (50 mM Tris، pH 8.0، 250 mM NaCl، 300 mM imidazole).صاف ٿيل پروٽين WB استعمال ڪندي طئي ڪيو ويو ۽ ڪنسنٽريشن کي Qubit™ پروٽين اسي کٽ (Thermo Fisher Scientific؛ Q 33212) استعمال ڪندي طئي ڪيو ويو.
RIP assays ڪيو ويو جيئن اڳ بيان ڪيو ويو، تبديلين سان.مختصر طور تي، 1x RIP بفر (25 mM Tris-HCl، pH 7.5، 100 mM NaCl، 0.5٪ NP-40، RNasin ribonuclease inhibitor (Promega)، PMSF (Beyotime Biotechnology)، 1 mM DDM، protease10000000000000000000000000000000000000000000000000000000000. (Roche، 1 mM DTT) ۽ سينٽرفيوج 13,000 rpm تي 15 منٽ لاءِ 4 °C تي.ان کان پوءِ سپرنيٽنٽ کي پروٽين A+G مقناطيسي موتي (ملي پور) سان 5 μg اينٽي PACT اينٽي باڊي (Abeam) يا IgG (CST) سان جوڙيو ويو.موتي 5 ڀيرا 5x RIP بفر سان ڌوئي ويا، پوء پروٽيناس K (NEB) سان هضم ڪيا ويا.آر اين اي Trizol سان ڪڍيو ويو ۽ RT-qPCR پاران طئي ڪيو ويو.پرائمر ضمني جدول 5 ۾ پيش ڪيا ويا آهن.
ان ويٽرو RIP assay هڪ تبديل ٿيل معياري RIP assay پروٽوڪول جي مطابق ڪيو ويو.ان ويٽرو ٽرانسڪرپٽ ٿيل آر اين اي جي ڪل 5 pmol کي 1x RIP بفر سان ملايو ويو ۽ انڪيوبيشن ذريعي 65 ° C تي 5 منٽن لاءِ انڪيوبيشن ڪيو ويو جنهن کان پوءِ ڪمري جي درجه حرارت تي سست کولنگ.مجموعي طور تي 5 pmol برقرار يا تبديل ٿيل پرچم ليبل ٿيل PACT پروٽينن کي E. coli مان صاف ڪيو ويو.4 ڊگري سينٽي گريڊ تي 2 ڪلاڪن لاءِ رينيچرڊ آر اين اي سان گڏ ڪريو ۽ اينٽي فليگ IP لاءِ RIP تجزيي لاءِ مٿين طريقي تي عمل ڪريو.
آر اين اي جي واڌ جي تجزيي لاء، 1xRIP بفر سان 1 × 107 سيلز ليز ڪيا ويا.13,000 rpm تي 15 منٽ لاءِ 4°C تي سينٽرفيوگريشن ڪرڻ کان پوءِ، سپرنيٽنٽ کي 30 μl streptavidin مقناطيسي موتي (Beckman) سان 2 h لاءِ 4°C تي اڳي ڪيو ويو.صاف ٿيل lysate پوءِ خمير tRNA سان فراهم ڪئي وئي ۽ 40 pmol renatured RNA سان رات جو 4 ° C تي انڪيوب ڪيو ويو، پوءِ وڌيڪ 2 ڪلاڪن لاءِ ۽ BSA سان بلاڪ ٿيل نئين اسٽريپٽاوڊين مقناطيسي موتي جو 20 μl شامل ڪيو ويو.ڌوئڻ جو مرحلو 4 ڀيرا 5x RIP بفر سان ۽ 4 ڀيرا 1x RIP بفر سان شامل آھي.لاڳاپيل پروٽين بايوٽين ايليوشن بفر (25 mM Tris-HCl، pH 7.5، 12.5 mM D-biotin، PMSF) سان ختم ڪيا ويا ۽ NuPAGE 4-12٪ Bis-Tris Gel (Invitrogen) تي الڳ ڪيا ويا.چانديءَ جي داغ کان پوءِ (Beyotime Biotechnology)، ڪجهه بينڊن کي ايڪسائيز ڪيو ويو ۽ MS پاران تجزيو ڪيو ويو.
Co-IP تجزيو PACT ۽ PKR جي وچ ۾ رابطي کي جانچڻ لاءِ ڪيو ويو.مختصر طور تي، سپرنيٽنٽ ليسيٽس تيار ڪيا ويا 1 x 107 lysed سيلز کي 1 x RIP بفر ۾ انڪيوبيٽ ڪندي 13,000 rpm تي سينٽرفيوگريشن 15 منٽن لاءِ 4°C تي.Lysates پروٽين A + G مقناطيسي موتي سان ڀريل هئا، 5 µg اينٽي PACT اينٽي باڊي سان ٺهڪندڙ، ۽ آرام سان رات جو 4 ° C تي گھمايو ويو.موتي 3 ڀيرا 5×RIP بفر سان ڌويا ويا، ٻه ڀيرا 1×RIP بفر سان ۽ 1×SDS بفر سان ڌوئي ويا.حاصل ڪيل پروٽين جو تجزيو ڪيو ويو SDS-PAGE gel ۽ WB پاران معلوم ڪيو ويو.
پرچم ٿيل PACT جا ٻه pmol ۽ PKR جي 1 pmol E. coli کان پاڪ ڪيا ويا.1× RIP بفر ۾ ملايو ۽ 4 ° C تي 2 ڪلاڪن لاءِ 10 pmol renatured RNA سان انڪيوبيٽ ڪريو.ان کان پوء، انهن کي پروٽين A+G مقناطيسي مالا-ڪنجوگيٽڊ اينٽي ليبل ٿيل اينٽي باڊي سان اضافي ٻن ڪلاڪن تائين لڳايو ويو.موتي وري 1x RIP بفر سان چار ڀيرا ڌوئي ويا ۽ 1x SDS بفر سان ايلٽ ڪيا ويا.نتيجي ۾ PACT ۽ PKR WB پاران معلوم ڪيا ويا.