خبرون

Nature.com گهمڻ لاءِ توهان جي مهرباني.برائوزر جو نسخو توهان استعمال ڪري رهيا آهيو محدود CSS سپورٽ آهي.بهترين تجربي لاءِ، اسان سفارش ڪريون ٿا ته توهان هڪ اپڊيٽ ٿيل برائوزر استعمال ڪريو (يا انٽرنيٽ ايڪسپلورر ۾ مطابقت واري موڊ کي بند ڪريو).ساڳئي وقت ۾، مسلسل حمايت کي يقيني بڻائڻ لاء، اسان سائيٽ کي بغير اسٽائل ۽ جاوا اسڪرپٽ پيش ڪنداسين.
Enzymatic proximity ليبلنگ جا طريقا ايڪٽيويٽ ايسٽرز يا phenoxy radicals جي بنياد تي وڏي پيماني تي استعمال ڪيا ويندا آهن نقشي ۾ سبسيلولر پروٽومس ۽ پروٽين انٽرڪٽرز کي جاندار سيلن ۾.جڏهن ته، چالو ٿيل ايسٽرز گهٽ رد عمل وارا آهن، نتيجي ۾ هڪ وسيع ليبلنگ ريڊيس، ۽ فينڪسائي ريڊيڪلز پيدا ڪيل پيرو آڪسائيڊ علاج ذريعي ريڊڪس رستن سان مداخلت ڪري سگهن ٿيون.هتي اسان رپورٽ ڪريون ٿا هڪ قربت ليبلنگ انحصار فوٽو ايڪٽيوشن (PDPL) طريقو جينياتي طور تي miniSOG photosensitizer پروٽين کي دلچسپي جي پروٽين سان ڳنڍڻ سان.نيري روشنيءَ سان ٺهڪندڙ ۽ نمائش جي وقت جي ذريعي ڪنٽرول ٿيل، سنگلٽ آڪسيجن پيدا ڪئي ويندي آهي ۽ پوءِ انيلين پروب ذريعي هسٽيڊائن جي باقيات جي spatiotemporally حل ٿيل ليبلنگ حاصل ڪئي ويندي آهي.اسان آرگنيل مخصوص پروٽوم ميپنگ ذريعي ان جي اعلي وفاداري جو مظاهرو ڪيو.PDPL جو هڪ طرفي مقابلو TurboID سان ڏيکاري ٿو PDPL جي وڌيڪ مخصوص ۽ جامع پروٽومڪ ڪوريج.اڳيون، اسان PDPL لاڳو ڪيو بيماري سان لاڳاپيل ٽرانسپشنل ڪوئڪٽيٽر BRD4 ۽ E3 Parkin ligase تي ۽ اڳ ۾ اڻڄاتل انٽرڪٽر مليا.اوور ايڪسپريشن اسڪريننگ ذريعي، ٻه اڻڄاتل ذيلي ذخيرا، Ssu72 ۽ SNW1، پارڪن لاءِ سڃاڻپ ڪيا ويا، جن جي تباهي ubiquitination-proteasome pathway جي وچ ۾ آهي.
پروٽين جي نيٽ ورڪ جي صحيح خاصيت ڪيترن ئي بنيادي سيلولر عملن کي هيٺ رکي ٿي.تنهن ڪري، پروٽين جي رابطي جي انتهائي درست اسپيٽيوٽيمپوريل ميپنگ حياتياتي رستن، بيمارين جي بيمارين، ۽ علاج جي مقصدن لاء انهن ڳالهين کي ختم ڪرڻ لاء هڪ سالماتي بنياد فراهم ڪندي.انهي جي نتيجي ۾، جاندار سيلز يا بافتن ۾ عارضي رابطي کي ڳولڻ جي قابل طريقا انتهائي گهربل آهن.Affinity Purification Mass Spectrometry (AP-MS) تاريخي طور تي استعمال ڪيو ويو آھي بائنڊنگ ڀائيوارن جي دلچسپي جي پروٽين (POIs) جي سڃاڻپ ڪرڻ لاء.مقداري پروٽومڪس طريقن جي ترقي سان، Bioplex3.0 ٺاهي وئي، پروٽين نيٽ ورڪ جو سڀ کان وڏو ڊيٽابيس AP-MS جي بنياد تي.جيتوڻيڪ AP-MS تمام طاقتور آهي، ڪم جي فلو ۾ سيل lysis ۽ dilution مرحلا ڪمزور ۽ عارضي پابند رابطي جي طرف متعصب آهن ۽ پوسٽ-lysis نموني متعارف ڪرايون ٿا جهڙوڪ غير معمولي رابطي جوڙو جيڪي lysis کان اڳ compartmentalization جي کوٽ آهي.
انهن مسئلن کي حل ڪرڻ لاء، غير فطري امينو اسيد (UAA) سان گڏ ڪراس لنڪنگ گروپ ۽ اينزيميٽڪ ويجھي ليبلنگ (PL) پليٽ فارمز (مثال طور APEX ۽ BioID) 5 ٺاهيا ويا آهن.جيتوڻيڪ UAA طريقو ڪاميابي سان ڪيترن ئي منظرنامن ۾ لاڳو ڪيو ويو آهي ۽ سڌو پروٽين جي چپن تي معلومات مهيا ڪري ٿي، UAA داخل ڪرڻ واري سائيٽ جي اصلاح اڃا به گهربل آهي.وڌيڪ اهم طور تي، اهو هڪ اسٽوچيوميٽرڪ ليبلنگ جو طريقو آهي جنهن ۾ ليبلنگ جي واقعن جي ڪيٽيليٽڪ ريورسل جي کوٽ ناهي.ان جي ابتڙ، اينزيميٽيڪل PL طريقا، جهڙوڪ BioID طريقو، انجنيئر ٿيل بايوٽين ligase کي POI7 کي فيوز ڪري ٿو، جيڪو بعد ۾ بايوٽين کي چالو ڪري ٿو هڪ رد عمل بايوٽينيل-AMP ايسٽر وچولي ٺاهڻ لاء.اهڙيءَ طرح اينزيم هڪ فعال بايوٽين ”ڪلائوڊ“ کي ڪيٽيلائيز ڪري ٿو ۽ جاري ڪري ٿو جيڪو ليبل لڳل لائسين جي باقيات کي نشانو بڻائي ٿو.بهرحال، BioID کي ڪافي ليبل ٿيل سگنل حاصل ڪرڻ لاءِ 12 ڪلاڪن کان وڌيڪ وقت جي ضرورت آهي، جيڪا ان جي استعمال کي عارضي قرارداد سان روڪي ٿي.خمير ڊسپلي جي بنياد تي هدايت ٿيل ارتقاء کي استعمال ڪندي، TurboID کي BioID جي بنياد تي وڌيڪ ڪارائتو بڻائڻ لاء ڊزائين ڪيو ويو، 10 منٽن اندر بايوٽين سان موثر ليبلنگ جي اجازت ڏني وئي، وڌيڪ متحرڪ عملن جي مطالعي جي اجازت ڏني وئي.ڇاڪاڻ ته TurboID انتهائي سرگرم آهي ۽ endogenous biotin ليول گهٽ-سطح جي ليبلنگ لاءِ ڪافي آهن، پس منظر ليبلنگ هڪ امڪاني مسئلو بڻجي ٿي جڏهن انتهائي بهتر ۽ وقتي ليبلنگ جي ضرورت هوندي آهي exogenous biotin جي اضافي سان.ان کان علاوه، چالو ٿيل ايسٽر ناقص رد عمل (t1/2 ~ 5 منٽ) هوندا آهن، جيڪي هڪ وڏي ليبلنگ ريڊيس ڏانهن وٺي سگهن ٿا، خاص طور تي بايوٽين 5 سان پاڙيسري پروٽين جي سنترپت ٿيڻ کان پوءِ. هڪ ٻئي طريقي ۾، انجنيئرڊ ايسڪربيٽ پيرو آڪسائيڊس جو جينياتي فيوزن (يعني بايوٽين- فينول ريڊيڪلز ۽ هڪ منٽ 9,10 اندر پروٽين جي ليبلنگ جي اجازت ڏئي ٿو. APEX وڏي پئماني تي استعمال ڪيو ويندو آهي ذيلي سيلولر پروٽومس، جھلي پروٽين ڪمپليڪس، ۽ سيٽوسولڪ سگنلنگ پروٽين ڪمپليڪس 11,12. جڏهن ته، پر آڪسائيڊ جي اعلي ڪنسنٽريشن جي ضرورت ريڊڪس پروٽينن يا رستن کي متاثر ڪري سگهي ٿي. سيلولر عمل.
اهڙيءَ طرح، هڪ نئون طريقو جيڪو وڌيڪ رد عمل واري ليبل ٿيل-ريڊيس سپپريشن اسپيسز پيدا ڪرڻ جي قابل هوندو، اعليٰ فضائي ۽ وقتي درستگي سان، سيلولر رستا کي خاص طور تي خراب ڪرڻ کان سواءِ، موجوده طريقن ۾ هڪ اهم اضافو هوندو. رد عمل واري نسلن جي وچ ۾، سنگلٽ آڪسيجن اسان جي ڌيان کي وڌايو ان جي مختصر زندگي جي ڪري ۽ محدود ڦهلائي ريڊيس (t1/2 <0.6 µs سيلز ۾) 13. رد عمل واري نسلن جي وچ ۾، سنگلٽ آڪسيجن اسان جي ڌيان کي وڌايو ان جي مختصر زندگي جي ڪري ۽ محدود ڦهلائي ريڊيس (t1/2 <0.6 µs سيلز ۾) 13. Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного, ограниченного и ограниченного и ограниченного и ограниченного и ограниченного и ограниченного. فعال شڪلن مان، سنگلٽ آڪسيجن اسان جي توجه ڪشش ڪئي ان جي مختصر حياتيءَ جي ڪري ۽ محدود ڊفيوژن ريڊيس (t1/2 <0.6 µs سيلز ۾)13.在活性物质中،单线态氧因其寿命短和扩散半径有限（细胞中t1/2 <0.6 µs）争耬. 1/2 < 0.6 µs）而引起了我们的注意13 Среди активных форм наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого времени жизни, ограниченноги и ограниченноговкает/ فعال شڪلن ۾، سنگلٽ آڪسيجن اسان جي توجه ڪشش ڪري ٿي ڇاڪاڻ ته ان جي مختصر زندگي ۽ محدود ڊفيوژن ريڊيس (سيلز ۾ t1/2 <0.6 μs).سنگلٽ آڪسيجن کي بي ترتيب طور تي ميٿيونائن، ٽائروسائن، هسٽيڊائن ۽ ٽرپٽوفن کي آڪسائيڊ ڪرڻ جي خبر ڏني وئي آهي، ان کي پولر 14,15 ٺاهيندي آهي امين يا ٿائل تي ٻڌل پروبس 16,17 سان ڳنڍڻ لاءِ.جيتوڻيڪ سنگلٽ آڪسيجن استعمال ڪيو ويو آهي ذيلي سيلولر ڪمپارٽمينٽ آر اين اي کي ليبل ڪرڻ لاءِ، حڪمت عمليون ختم ٿيڻ واري POI قربت جي نشانن کي ٻيهر ڏيڻ لاءِ اڻڄاتل رهي ٿو.هتي، اسان هڪ پليٽ فارم پيش ڪريون ٿا جنهن کي photoactivation-dependent proximity labeling (PDPL) سڏيو ويندو آهي، جتي اسان نيري روشني استعمال ڪندا آهيون POIs کي روشن ڪرڻ لاءِ جيڪو miniSOG فوٽوسينسائٽيزر سان ملندو آهي ۽ سنگلٽ آڪسيجن جنريشن کي ٽريگر ڪري ٿو ويجهڙائيءَ واري ريزيديوز کي آڪسائيڊ ڪرڻ لاءِ، جنهن جي پٺيان امين تي مشتمل تبديليون آڪسائيڊ ڪرڻ لاءِ ڪيميائي جاچ ۾. وچولي جاندار سيلز..اسان ٽيگ جي خاصيت کي وڌائڻ لاءِ ڪيميائي جاچ جي هڪ گروپ کي آزمايو ۽ اوپن پروٽومڪس ورڪ فلو استعمال ڪندي ترميمي سائيٽن جي نشاندهي ڪئي.PDPL جو هڪ طرفي مقابلو TurboID سان ڏيکاري ٿو PDPL جي وڌيڪ مخصوص ۽ جامع پروٽومڪ ڪوريج.اسان هن طريقي کي لاڳو ڪيو organelle-specific markers of organelle-specific markers of subcellular proteome and General proteome identification of binding partners for the cancer-sosiated epigenetic regulatory protein BRD4 ۽ پارڪنسن جي بيماري سان لاڳاپيل E3 ligase Parkin، جنهن جي تصديق ڪئي وئي ٻنهي ڄاتل ۽ اڻ ڄاتل نيٽ ورڪ جي پروٽين. ڳالهه ٻولهه.PDPL جي صلاحيت وڏي پروٽين ڪمپليڪس ۾ E3 ذيلي ذخيري کي سڃاڻڻ واري صورتحال جي نمائندگي ڪري ٿي جتي اڻ سڌي طرح بائنر جي سڃاڻپ گهربل آهي.ubiquitination-proteasome جي وچ ۾ ٻه نامعلوم پارڪن سبسٽرا سٽي ۾ تصديق ڪئي وئي آهي.
فوٽوڊينامڪ ٿراپي (PDT) 19 ۽ ڪروموفور جي مدد سان ليزر غير فعال ٿيڻ (CALI) 20، جنهن ۾ ڦوٽو سينسائٽرز سان روشني جي شعاع سنگلٽ آڪسيجن پيدا ڪري ٿي، ٽارگيٽ پروٽين کي غير فعال ڪري سگهي ٿي يا سيل جي موت جو سبب بڻجي سگهي ٿي.جيئن ته سنگلٽ آڪسيجن هڪ انتهائي رد عمل وارو مادو آهي جنهن جي نظرياتي ڦهلاءَ جي مفاصلي تي اٽڪل 70 nm آهي، ان ڪري فوٽو سينسائيزر جي چوڌاري محدود آڪسيجن کي ڪنٽرول ڪري سگهجي ٿو.هن تصور جي بنياد تي، اسان اڪيلو آڪسيجن استعمال ڪرڻ جو فيصلو ڪيو ته جاندار خاني ۾ پروٽين ڪمپليڪس جي ويجهو ليبلنگ حاصل ڪرڻ لاء.اسان چار ڪمن کي پورو ڪرڻ لاءِ هڪ PDPL ڪيموپروٽومڪ طريقه ڪار ٺاهيا آهن: (1) فعال سنگلٽ آڪسيجن جي نسل کي متحرڪ ڪرڻ لاءِ PL اينزيميٽڪ طريقي سان ملندڙ.(2) روشني جي شروعات تي وقت حل ٿيل ليبلنگ مهيا ڪريو؛(3) ڦيرڦار سان (4) پس منظر کي گهٽائڻ لاءِ endogenous cofactors (جهڙوڪ بايوٽين) استعمال ڪرڻ کان پاسو ڪريو، يا ماحولياتي دٻاءُ کي سيل جي نمائش کي گھٽ ڪرڻ لاءِ انتهائي خراب ڪندڙ خارجي ريجنٽس (جهڙوڪ پر آڪسائيڊس) استعمال ڪريو.
Photosensitizers ٻن ڀاڱن ۾ ورهائي سگھجن ٿا جن ۾ ننڍا ماليڪيولر وزن فلوروفورس (مثال طور گلاب بنگال، ميٿيلين بليو) 22 ۽ جينياتي طور انڪوڊ ٿيل ننڍڙا پروٽين (مثال طور miniSOG، KillerRed) 23.ماڊيولر ڊيزائن حاصل ڪرڻ لاءِ، اسان POI24,25 (Figure 1a) ۾ Photosensitizer (PS) پروٽين شامل ڪري پھرين نسل PDPL پليٽ فارم تيار ڪيو.جڏهن نيري روشني سان شعاع ڪيو وڃي ٿو، سنگلٽ آڪسيجن پروڪسمل نيوڪليوفيلڪ امينو ايسڊ جي باقيات کي آڪسائيڊ ڪري ٿي، جنهن جي نتيجي ۾ هڪ umpolung polarity آهي جيڪا اليڪٽرروفيلڪ آهي ۽ اڳتي هلي amine probe nucleophiles16,17 سان رد عمل ڪري سگهي ٿي.پروب هڪ الڪائن هينڊل سان ٺهيل آهي ته جيئن ڪلڪ ڪيمسٽري جي اجازت ڏئي ۽ LC/MS/MS خصوصيت لاءِ هيٺ لهي.
miniSOG پاران وچولي پروٽين ڪمپليڪس جي ليبلنگ جي اسڪيمياتي مثال.جڏهن نيري روشنيءَ کي ظاهر ڪيو وڃي ٿو، سيلز miniSOG-POI جو اظهار ڪن ٿا سنگلٽ آڪسيجن پيدا ڪن ٿا، جيڪو مٽائيندڙ پروٽين کي تبديل ڪري ٿو پر غير پابند پروٽينن کي نه.فوٽو آڪسائيڊشن جي وچ واري پروڊڪٽس کي امين ڪيميائي جاچ جي رلي ليبل ذريعي روڪيو ويو آهي ته جيئن covalent addducts ٺاهي.ڪيمسٽري پروب تي الڪائنل گروپ ڪلڪ ڪيمسٽري کي افزودگي لاءِ پل-ڊائون ذريعي ۽ بعد ۾ LC-MS/MS مقدار جي اجازت ڏئي ٿو.b امين پروبس جي ڪيميائي ساخت 1-4.c نمائندي فلورسنٽ جيل جو تجزيو mitochondrial localized miniSOG-mediated proteomic markers probes 1-4 استعمال ڪندي ۽ gel densitometry جي بنياد تي لاڳاپو مقدار.ڪيميائي تحقيقات جي سگنل کان پس منظر جي تناسب جو جائزو ورتو ويو منفي ڪنٽرول تجربن کي استعمال ڪندي، نيري روشني کان سواء يا HEK293T سيلز کي miniSOG اظهار کان سواء استعمال ڪندي.n = 2 حياتياتي طور تي آزاد نموني.هر نقطو هڪ حياتياتي نقل جي نمائندگي ڪري ٿو.d نمايان ٿيل PDPL اجزاء جي موجودگي يا غير موجودگي ۾ اصلاحي جاچ 3 استعمال ڪندي PDPL جي نمائندي جي سڃاڻپ ۽ مقدار جو اندازو لڳائڻ جهڙوڪ c.n = 3 حياتياتي طور تي آزاد نموني.هر نقطو هڪ حياتياتي نقل جي نمائندگي ڪري ٿو.سينٽر لائنون ۽ ويڪرز مطلب ۽ ± معياري انحراف جي نمائندگي ڪن ٿا.CBB: Coomassie Brilliant Blue.اي سنگلٽ آڪسيجن جي ڪنفوڪل تصويري پري-لال Si-DMA داغ سان.اسڪيل بار: 10 µm.جيل اميجنگ ۽ ڪنفوڪل تجربا آزاديء سان بار بار ڪيا ويا گهٽ ۾ گهٽ ٻه ڀيرا ساڳئي نتيجن سان.
اسان پھريون ڀيرو پروٽووم جي پروپارگيلامائن ليبلنگ کي ڪيميائي جاچ جي طور تي ثالثي ڪرڻ لاءِ، HEK293T ۾ واضح طور تي ظاهر ڪيل بالغ ڦوٽو سنسڪرت ڪندڙ miniSOG26 ۽ KillerRed23 جي صلاحيت کي آزمايو (ضمني تصوير 1a).جيل فلوروسينس تجزيي ڏيکاري ٿي ته پوري پروٽوم ليبلنگ miniSOG ۽ نيري روشني شعاع استعمال ڪندي حاصل ڪئي وئي، جڏهن ته KillerRed سان ڪو به ليبلنگ پراڊڪٽ ڏسڻ ۾ نه آيو.سگنل کان پس منظر جي نسبت کي بهتر ڪرڻ لاءِ، اسان وري ڪيميائي جاچن جو هڪ سيٽ آزمايو جنهن ۾ اينلين (1 ۽ 3)، پروپليامين (2)، يا بينزيلامين (4) شامل آهن.اسان ڏٺو ته HEK293T سيلز پاڻ ۾ وڌيڪ پس منظر سگنل هئا بغير ڪنهن نيري روشني جي مقابلي ۾، ممڪن آهي ته انڊوجينس ربوفلاوين فوٽوسينسائيزر، فلوين مونونيو ڪليوٽائيڊ (FMN) 27 جي ڪري. انيلائن تي ٻڌل ڪيميائي جاچ 1 ۽ 3 بهتر خصوصيت ڏني، HEK293T سان miniSOG جو اظهار ڪندي mitochondria ۾ 8-گنا واڌ ڏيکاريندي پروب 3 لاءِ سگنل، جڏهن ته پروب 2 استعمال ڪيو ويو RNA-ليبلنگ جي طريقي CAP-seq ۾ صرف ~2.5- ڏيکاري ٿو. فولڊ سگنل وڌائي، ممڪن آهي ته آر اين اي ۽ پروٽين جي وچ ۾ مختلف رد عمل جي ترجيحن جي ڪري (تصوير 1b، ج). انيلائن تي ٻڌل ڪيميائي جاچ 1 ۽ 3 بهتر خصوصيت ڏني، HEK293T سان miniSOG جو اظهار ڪندي mitochondria ۾ 8-گنا واڌ ڏيکاريندي پروب 3 لاءِ سگنل، جڏهن ته پروب 2 استعمال ڪيو ويو RNA-ليبلنگ جي طريقي CAP-seq ۾ صرف ~2.5- ڏيکاري ٿو. فولڊ سگنل وڌائي، ممڪن آهي ته آر اين اي ۽ پروٽين جي وچ ۾ مختلف رد عمل جي ترجيحن جي ڪري (تصوير 1b، ج).انيلائن تي ٻڌل ڪيميائي جاچ 1 ۽ 3 بهتر نموني ڏيکاريا آهن: HEK293T، جيڪو مائيٽوڪونڊريا ۾ miniSOG کي مستحڪم طور تي ظاهر ڪري ٿو، پروب 3 لاءِ سگنل ۾ 8 گنا کان وڌيڪ اضافو ڏيکاري ٿو، جڏهن ته پروب 2، CAP-seq RNA ليبلنگ جي طريقي ۾ استعمال ڪيو ويو، صرف ڏيکاري ٿو ~ 2.5-گنا سگنل وڌائي، شايد RNA ۽ پروٽين جي وچ ۾ مختلف رد عمل جي ترجيحن جي ڪري (Fig. 1b، c).基于 基于 的 的 化学 的 的 更 好 更 更 好 好 表达 表达 表达 表达 在 在 表达 在 在 在 在 在 在 信号 信号، 而 用 用 用 显示 显示 ~ 的 显示 显示 ~ 的2.5-倍信号增加، 可能是由于RNA 和蛋白质之间的不同反应偏好（图1b،c.基于 的 的 的 化学 化学 具有 更 更 更 更 的 表达 表达 粒体 表达 表达 粒体 粒体 在 中 中 信号 信号 信号 信号 增加 信号 增加 ~ ~ ~ qa ~ q 而 q ~ q 于 仅- 倍信号增加,可能是由于RNAانيلائن تي ٻڌل ڪيميائي جاچ 1 ۽ 3 ۾ بهتر خصوصيت هئي، HEK293T مستحڪم طور تي mitochondria ۾ miniSOG جو اظهار ڪيو، ۽ پروب 3 سگنل ۾ 8-گنا واڌارو ڪيو، جڏهن ته CAP-seq RNA ليبلنگ جي طريقي جي جاچ 2 صرف ~ 2.5-گنا واڌ ڏيکاري ٿي.سگنل ۾، شايد آر اين اي ۽ پروٽين جي وچ ۾ مختلف ردعمل ترجيحن جي ڪري (تصوير 1b، ج).ان کان علاوه، پروب 3 isomers ۽ hydrazine پروبس (پروبس 5، 6، 7) آزمايا ويا، پروب 3 جي اصلاح جي تصديق ڪن ٿا (ضمني تصوير 1b،c).اهڙي طرح، ان-جيل فلوروسينس تجزيي ٻين بهتر تجرباتي پيرا ميٽرز کي ظاهر ڪيو: شعاع جي موج جي ڊيگهه (460 nm)، ڪيميائي جاچ ڪنسنٽريشن (1 ايم ايم)، ۽ شعاع جو وقت (20 منٽ) (ضمني شڪل 2a-c).PDPL پروٽوڪول ۾ ڪنهن به جزو يا قدم کي ختم ڪرڻ جي نتيجي ۾ اهم سگنل پس منظر ڏانهن موٽڻ جي نتيجي ۾ (Fig. 1d).خاص طور تي، پروٽين جي ليبلنگ کي خاص طور تي سوڊيم azide يا trolox جي موجودگي ۾ گھٽجي ويو آهي، جيڪي سڃاتل آڪسيجن کي اڪيلو ڪن ٿا.D2O جي موجودگي، جيڪو سنگلٽ آڪسيجن کي مستحڪم ڪرڻ لاء سڃاتو وڃي ٿو، ليبلنگ سگنل کي وڌايو.ليبلنگ ۾ ٻين رد عمل واري آڪسيجن جي نسلن جي مدد جي تحقيق ڪرڻ لاءِ، مينيٽول ۽ وٽامن سي شامل ڪيا ويا هائيڊروڪسيل ۽ سپر آڪسائيڊ ريڊيڪل اسڪيوينجرز کي ترتيب ڏيڻ لاءِ، ترتيبوار 18، 29، پر انهن کي ليبلنگ کي گهٽائڻ لاءِ نه مليا.H2O2 جو اضافو، پر روشني نه، ليبلنگ جي نتيجي ۾ نه ٿيو (ضمني تصوير. 3a).سي-ڊي ايم اي پروبس سان فلورسنس سنگلٽ آڪسيجن اميجنگ HEK293T-miniSOG تار ۾ سنگلٽ آڪسيجن جي موجودگي جي تصديق ڪئي، پر اصل HEK293T تار ۾ نه.ان کان علاوه، mitoSOX ريڊ روشنيءَ کان پوءِ سپر آڪسائيڊ جي پيداوار کي ڳولي نه سگهيو (تصوير 1e ۽ ضمني تصوير. 3b) 30. اهي ڊيٽا مضبوط طور تي ٻڌائين ٿا ته سنگلٽ آڪسيجن مکيه رد عمل آڪسيجن نسل آهي جيڪو ايندڙ پروٽومڪ ليبلنگ لاءِ ذميوار آهي.PDPL جي سائٽوٽوڪسائيٽي جو جائزو ورتو ويو جنهن ۾ نيري روشني جي شعاع ۽ ڪيميائي جاچ شامل آهن، ۽ ڪا به اهم cytotoxicity نظر نه آئي (ضمني تصوير. 4a).
ليبلنگ ميکانيزم جو مطالعو ڪرڻ ۽ LC-MS/MS استعمال ڪندي پروٽين ڪمپليڪس جي پروٽومڪ سڃاڻپ کي فعال ڪرڻ لاءِ، اسان کي پهريان اهو طئي ڪرڻو پوندو ته ڪهڙيون امينو اسيد تبديل ٿيل آهن ۽ پروب ليبلز جو ڊيلٽا ماس.Methionine، histidine، tryptophan ۽ tyrosine ٻڌايو ويو آهي ته سنگلٽ آڪسيجن 14,15 ذريعي تبديل ٿي ويا آهن.اسان MSFragger32 جي بنياد تي FragPipe ڪمپيوٽنگ پليٽ فارم پاران مهيا ڪيل غير جانبدار اوپن سرچ سان TOP-ABPP31 ورڪ فلو کي ضم ڪريون ٿا.سنگلٽ آڪسيجن جي ترميم ۽ ڪيميائي جاچ ليبلنگ کان پوءِ، ڪلڪ ڪيمسٽري کي بايوٽين ريڊڪشن ليبل استعمال ڪندي ڪيو ويو جنهن ۾ ڪليوبل لنڪر شامل آهي، جنهن کانپوءِ نيوٽراويڊين اسٽريچنگ ۽ ٽرپسن هضم.تبديل ٿيل پيپٽائڊ، اڃا تائين رال جي پابند، LC-MS/MS تجزيي لاءِ فوٽو ڪليو ڪيو ويو (شڪل 2a ۽ ضمني ڊيٽا 1).تبديلين جو هڪ وڏو تعداد سڄي پروٽوم ۾ واقع ٿيو 50 کان وڌيڪ پيپٽائڊ ميپ (PSM) سان گڏ فهرست ڏنل (Fig. 2b).حيرت انگيز طور تي، اسان صرف هسٽائيڊائن جي تبديلي کي ڏٺو، شايد ٻين امينو اسيدن جي ڀيٽ ۾ اينلين پروب جي طرف آڪسائيڊ ٿيل هسٽائيڊائن جي اعلي رد عمل جي ڪري.سنگلٽ آڪسيجن ذريعي هسٽائيڊائن آڪسائيڊشن جي شايع ٿيل ميڪانيزم موجب، 21,33 +229 Da جي تجويز ڪيل ڊيلٽا-ماس ڍانچي ٻن آڪسائيڊشنن کان پوءِ 2-oxo-histidine سان پروب 3 جي اضافو سان مطابقت رکي ٿي، جڏهن ته +247 Da هائيڊولائسز پراڊڪٽ آهي. +229 Da (ضمني تصوير 5).MS2 اسپيڪٽرم جو اڀياس ڏيکاريو ويو آھي ھڪڙي اعلي اعتبار جي سڃاڻپ جي گھڻا y ۽ b آئنز، جن ۾ تبديل ٿيل ٽڪرا آئنز (y ۽ b) (Fig. 2c) جي سڃاڻپ شامل آھن.PDPL-تبديل ٿيل هسٽائڊائنز جي مقامي تسلسل جي حوالي سان تجزيو ظاهر ڪيو ته ±1 پوزيشن تي ننڍي هائيڊروفوبڪ ريزيديو لاء هڪ وچولي نموني ترجيح ڏني وئي (ضمني تصوير. 4b).سراسري طور تي، 1.4 هسٽائڊائن جي سڃاڻپ ڪئي وئي في پروٽين، ۽ انهن نشانن جي سائيٽن جو اندازو لڳايو ويو سولوينٽ رسائيبل سطح واري علائقي (SASA) ۽ رشتي سالوينٽ دستيابي (RSA) تجزيو (ضمني تصوير 4c،d).
MSFragger پاران طاقتور FragPipe ڪمپيوٽنگ پليٽ فارم استعمال ڪندي بقا جي چونڊ جي مطالعي لاءِ هڪ غير جانبدار ڪم فلو.Cleavable linkers ڪلڪ ڪيمسٽري ۾ استعمال ڪيا ويندا آھن ته جيئن اسٽريپٽاوڊين رين مان تبديل ٿيل پيپٽائڊس جي فوٽو ڪليويج جي اجازت ڏني وڃي.هڪ کليل ڳولا شروع ڪئي وئي ڪيترن ئي ترميمن جي سڃاڻپ ڪرڻ لاء، انهي سان گڏ لاڳاپيل باقيات.ب سڄي پروٽوم ۾ ٿيندڙ تبديلين جي ڪاميٽي کي مقرر ڪريو.پيپٽائڊ ميپنگ PSM.c MS2 spectral anotation of histidine sites modified with probe 3. هڪ نمائندي مثال طور، probe 3 سان covalent react +229.0938 Da کي تبديل ٿيل امينو اسيد ۾ شامل ڪيو ويو.d ميوٽيشن جو امتحان PDPL مارڪرن لاءِ استعمال ڪيو ويو.PRDX3 (H155A، H225A) ۽ PRDX1 (H10A، H81A، H169A) جھنگلي قسم جي پلاسميڊ سان مخالف پرچم جي چڪاس لاءِ منتقل ڪيا ويا.e مصنوعي پيپٽائڊ کي پروب 3 جي موجودگي ۾ صاف ٿيل miniSOG سان رد ڪيو ويو ۽ Δm +247 ۽ +229 سان لاڳاپيل مصنوعات LC-MS اسپيڪٽرم ۾ نوٽ ڪيا ويا.f ويٽرو پروٽين کان پروٽين جي وچ ۾ رابطي جو نمونو miniSOG-6xHis-tag ۽ anti-6xHis اينٽي باڊي سان.اينٽي بايوٽين (اسٽريپٽاوڊين-ايڇ آر پي) ۽ اينٽي ماؤس ويسٽرن بلٽ جو تجزيو miniSOG-6xHis/anti-6xHis اينٽي باڊي ڪمپليڪس جو ليبل پروب 3 سان، روشني جي نمائش جي وقت تي منحصر آهي.انفرادي پروٽينن لاءِ ليبل لاڳاپيل ماليڪيولر وزن ۾ ظاهر ڪيا ويا آهن: LC اينٽي باڊي لائٽ چين، HC اينٽي باڊي ڳري زنجير.اهي تجربا آزاديء سان گهٽ ۾ گهٽ ٻه ڀيرا ورجائي رهيا هئا ساڳئي نتيجن سان.
ليبلنگ سائيٽ جي بايو ڪيميڪل تصديق لاءِ، ماس اسپيڪٽروميٽري جي سڃاڻپ ڪيل PRDX3 ۽ PRDX1 کي هسٽيڊائن کان الانائن ۾ تبديل ڪيو ويو ۽ ان جي مقابلي ۾ وائلڊ قسم جي منتقلي اسيڪس ۾.PDPL نتيجن مان ظاهر ٿيو ته ميوٽيشن خاص طور تي ليبلنگ کي گهٽائي ڇڏيو (تصوير 2d).ان دوران، اوپن سرچ ۾ سڃاڻپ ڪيل پيپٽائڊ جي ترتيبن کي پروب 3 ۽ نيري لائٽ جي موجودگيءَ ۾ ويٽرو ۾ صاف ڪيل miniSOG سان گڏ ڪيو ويو ۽ رد عمل ڪيو ويو، پروڊڪٽس حاصل ڪرڻ سان گڏ +247 ۽ +229 Da جي ماس شفٽ سان جڏهن LC-MS (تصوير) جي نشاندهي ڪئي وئي. . 2e).).جانچڻ لاءِ ته ڇا پراڪسيمل پروٽينن کي miniSOG فوٽو ايڪٽيوشن جي جواب ۾ ويٽرو ۾ ليبل ڪري سگهجي ٿو، اسان miniSOG-6xHis پروٽين ۽ ويٽرو ۾ هڪ اينٽي هز مونوڪلونل اينٽي باڊي جي وچ ۾ رابطي ذريعي هڪ مصنوعي قربت جو اندازو لڳايو (شڪل 2f).هن جائزي ۾، اسان miniSOG سان اينٽي باڊي ڳري ۽ هلڪي زنجيرن جي ويجهڙائي واري ليبلنگ جي توقع ڪئي.حقيقت ۾، اينٽي ماؤس (اينٽي 6x هِس-ليبل ٿيل اينٽي باڊي جي ڳري ۽ هلڪي زنجيرن کي سڃاڻڻ) ۽ اسٽريپٽاوڊين ويسٽرن بلٽس ڳري ۽ هلڪي زنجيرن جي مضبوط بايوٽينيليشن ڏيکاريا.خاص طور تي، اسان 6xHis ٽيگ جي ڪري miniSOG autobiotinylation محسوس ڪيو ۽ روشني ۽ ڳري زنجيرن جي وچ ۾ ڪراس لنڪس، جيڪي شايد اڳ بيان ڪيل فرق سان لاڳاپيل هجن ليسين ۽ 2-oxo-histidine proximal جواب جي وچ ۾.آخر ۾، اسان اهو نتيجو ڪريون ٿا ته PDPL هسٽيڊائن کي ويجهي انحصار انداز ۾ تبديل ڪري ٿو.
اسان جو ايندڙ مقصد اهو هو ته ذيلي سيلولر پروٽوم جي خاصيت کي جانچڻ لاءِ سيٽيو ليبلنگ ۾.تنهن ڪري، اسان مستحڪم طور تي miniSOG جو اظهار ڪيو نيوڪيوس ۾، mitochondrial matrix، يا HEK293T سيلز جي ٻاهرئين ER جھلي (Fig. 3a).جيل فلوروسينس تجزيي ظاهر ڪيو ته گهڻو ڪري ليبل ٿيل بينڊ ٽن ذيلي ذيلي جڳهن تي گڏوگڏ مختلف ليبلنگ نمونن (تصوير 3b).فلورسنس اميجنگ تجزيي ڏيکاري ٿي PDPL جي اعلي خاصيت (Fig. 3c).PDPL جي ڪم جي فلو جي پٺيان rhodamine رنگن سان ڪلڪ ڪيو ويو رد عمل فلورسنس مائڪرو اسڪوپي استعمال ڪندي ذيلي سيلولر پروٽومز کي بيان ڪرڻ لاءِ، ۽ PDPL سگنلز کي DAPI، mitochondrial ٽريڪرز، يا ER ٽريڪرز سان گڏ ڪيو ويو، PDPL جي اعليٰ ايمانداري جي تصديق ڪندي.ٽن آرگنيل جڳهن لاءِ، پي ڊي پي ايل جو هڪ طرفي مقابلو TurboID سان avidin مغربي بلٽ استعمال ڪندي ڏيکاريو ويو آهي ته PDPL انهن جي لاڳاپيل ڪنٽرولن جي مقابلي ۾ وڌيڪ خاص طور تي ليبل ڪيو ويو آهي.PDPL جي حالتن ۾، وڌيڪ ليبل ٿيل بينڊ ظاهر ٿيا، وڌيڪ PDPL-ليبل ٿيل پروٽين (ضمني تصوير. 6a-d).
miniSOG-mediated organelle-specific proteome ليبلنگ جي اسڪيمياتي نمائندگي.miniSOG انساني COX4 (mito-miniSOG) جي اين-ٽرمينل 23 امينو اسيدز کي فيوژن ذريعي، نيوڪليس ذريعي H2B (نيوڪليس-miniSOG)، ۽ Sec61β کي ER جھلي (ER-miniSOG) جي cytoplasmic پاسي ذريعي فيوزن ذريعي mitochondrial ميٽرڪس کي نشانو بڻائيندو آهي. ).اشارن ۾ جيل اميجنگ، ڪنفوڪل اميجنگ، ۽ ماس اسپيڪٽروميٽري شامل آهن.b ٽي آرگنيل-مخصوص PDPL پروفائلز جي نمائندي جيل تصويرون.CBB Coomassie شاندار نيرو.c HEK293T سيلز جي نمائندي ڪنفوڪل تصويرون stably miniSOG کي ظاهر ڪن ٿيون مختلف ذيلي سيلولر لوڪلائيزيشن سان معلوم ٿيل اينٽي باڊي V5 (ڳاڙهي) سان.Subcellular نشانن کي mitochondria ۽ ER (سائي) لاء استعمال ڪيو ويندو آهي.PDPL ورڪ فلو ۾ شامل آهي miniSOG (پيلو) ليبل ٿيل سب سيلولر پروٽومز جي ڳولا Cy3-azide ڪلڪ ڪيمسٽري استعمال ڪندي.اسڪيل بار: 10 µm.d مختلف آرگنيلز ۾ PDPL-ٽيگ ٿيل پروٽومس جا آتش فشاني پلاٽ غير ليبل ٿيل مقدار (n = 3 آزاد حياتياتي تجربا) جي مقدار جي حساب سان.ٻن دم واري شاگردن جي ٽي ٽيسٽ آتش فشاني پلاٽن تي استعمال ڪئي وئي.HEK293T جهنگلي قسم هڪ منفي ڪنٽرول طور استعمال ڪيو ويو. خاص طور تي تبديل ٿيل پروٽين ڳاڙهي ۾ نمايان ٿيل آهن (p <0.05 ۽> 2-fold آئن شدت فرق). خاص طور تي تبديل ٿيل پروٽين ڳاڙهي ۾ نمايان ٿيل آهن (p <0.05 ۽> 2-fold آئن شدت فرق). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интенсивности ионов). خاص طور تي تبديل ٿيل پروٽين ڳاڙهي ۾ نمايان ٿيل آهن (p <0.05 ۽> آئن جي شدت ۾ 2-گنا فرق).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p <0.05 和> 2 倍离子强度差异）.显着变化的蛋白质以红色突出显示（p <0.05和>2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе). خاص طور تي تبديل ٿيل پروٽينن کي ڳاڙهي رنگ ۾ نمايان ڪيو ويو آهي (p <0.05 ۽ > 2-fold فرق آئنڪ طاقت ۾).لاڳاپيل پروٽين HEK293T-miniSOG لاءِ اھم آھن پر HEK293T لاءِ اھم ناھن سائي ۾ ڏيکاريا ويا آھن.e تجربا کان پروٽومڪ ڊيٽا سيٽ جي خاصيت جو تجزيو ڊي.هر عضوي ۾ شمارياتي لحاظ کان اهم پروٽينن جو ڪل تعداد (ڳاڙهو ۽ سائو نقطو) مٿي تي نشان لڳل آهي.هسٽوگرام ڏيکارين ٿا پروٽينن کي آرگنيلز ۾ مقامي طور تي MitoCarta 3.0، GO analysis ۽ A. Ting et al.ماڻهو.mitochondria، nuclei، ۽ ER لاء جدا جدا ڊيٽا سيٽ.اهي تجربا آزاديء سان گهٽ ۾ گهٽ ٻه ڀيرا ورجائي رهيا هئا ساڳئي نتيجن سان.خام ڊيٽا خام ڊيٽا فائلن جي صورت ۾ مهيا ڪيل آهن.
جيل ۽ اميجنگ جي نتيجن جي حوصلا افزائي ڪئي وئي، ليبل-مفت مقدار کي استعمال ڪيو ويو هر آرگنيل ۾ سڃاڻپ پروٽوم کي مقدار ڏيڻ لاء (ضمني ڊيٽا 2).Untransfected HEK293T پس منظر مارڪرز کي ختم ڪرڻ لاءِ منفي ڪنٽرول طور استعمال ڪيو ويو. آتش فشاني پلاٽ جي تجزيي ۾ نمايان طور تي افزائش ٿيل پروٽين (p <0.05 ۽ > 2-fold ion intensity) ۽ گڏوگڏ سنگلٽن پروٽين جيڪي صرف miniSOG-ظاهر ڪندڙ لائينن ۾ موجود آهن (تصوير 3d ڳاڙهي ۽ سائي نقطي). آتش فشاني پلاٽ جي تجزيي ۾ نمايان طور تي افزائش ٿيل پروٽين (p <0.05 ۽ > 2-fold ion intensity) ۽ گڏوگڏ سنگلٽن پروٽين جيڪي صرف miniSOG-ظاهر ڪندڙ لائينن ۾ موجود آهن (تصوير 3d ڳاڙهي ۽ سائي نقطي). Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG (рис. 3d, красные и зеленые точки). آتش فشاني پلاٽ جي تجزيي ۾ نمايان طور تي افزائش ٿيل پروٽين (p<0.05 ۽ >2-fold ion intensity) ۽ گڏوگڏ واحد پروٽين جيڪي صرف miniSOG-ظاهر ڪرڻ واري لائنن ۾ موجود آهن (تصوير 3d، ڳاڙهي ۽ سائي نقطا).火山图 火山图 分析 显示 出 出 显着 蛋白质 蛋白质 (P <0.05 倍 离子 离子 离子 表达 表达 单 单 单 单 单 单 单 单 单 单 单 单 单 单 单 单 蛋白质 蛋白质 和 和 和 和 和 和 和 和 和 和 和 和 和).فٽين 显示 显示 出 出 的 显着 出 显着 显着 出 出 出 (图 3 单 单 单 单 单 强度))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))))) Анализ графика вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG (красные и зеленые точки на рис. 3d). آتش فشاني پلاٽ جي تجزيي ظاهر ڪيو ته خاص طور تي افزوده پروٽين (p <0.05 ۽ > 2x ionic طاقت) ۽ گڏوگڏ واحد پروٽين صرف miniSOG ايڪسپريشن لائن ۾ موجود آهن (شڪل 3d ۾ ڳاڙهي ۽ سائي نقطا).انهن ڊيٽا کي گڏ ڪندي، اسان سڃاڻپ ڪئي 1364، 461، ۽ 911 شمارياتي طور تي اهم ايٽمي، mitochondrial، ۽ ER ٻاهرئين جھلي پروٽين، ترتيب سان.organelle-localized PDPL جي درستگي کي تجزيو ڪرڻ لاء، اسان استعمال ڪيو MitoCarta 3.0، جين آنٽولوجي (GO) تجزيو، ۽ A. Ting et al.هڪ ڊيٽا سيٽ 8 استعمال ڪيو ويو mitochondria، nucleus، ۽ ER لاءِ استعمال ڪيو ويو معلوم ڪيل پروٽين جي آرگنيل خاصيت کي جانچڻ لاءِ، 73.4، 78.5، ۽ 73.0٪ جي درستگي سان (تصوير 3e).PDPL جي خاصيت تصديق ڪري ٿي ته PDPL آرگنيل-مخصوص پروٽومز جي سڃاڻپ لاءِ هڪ مثالي اوزار آهي.خاص طور تي، سڃاڻپ ٿيل mitochondrial پروٽين جي ذيلي ذخيري تجزيي ڏيکاري ٿي ته پڪڙيل پروٽوم خاص طور تي ميٽرڪس ۽ اندروني جھلي (226 ۽ 106، ترتيب سان) ۾ ورهايو ويو، سڃاڻپ ٿيل mitochondrial پروٽين جي ڪل تعداد جي 91.7٪ (362) جي حساب سان.PDPL جي اعلي سطح جي اضافي طور تي تصديق ڪئي وئي (ضمني تصوير. 7a).اهڙي طرح، ذيلي نيوڪليئر تجزيي ڏيکاري ٿي ته قبضو ڪيل پروٽوم خاص طور تي نيوڪليس، نيوڪلوپلازم ۽ نيوڪليوولس ۾ ورهايو ويو هو (ضمني شڪل 7b).ايٽمي لوڪلائيزيشن سگنل پيپٽائڊ (3xNLS) سان ايٽمي پروٽومڪ تجزيي H2B جي ٺاھڻ جي ساڳي درستگي ڏيکاري ٿي (ضمني تصوير. 7c-h).PDPL مارڪر جي خاصيت کي طئي ڪرڻ لاء، ايٽمي ليمينن اي کي چونڊيو ويو هڪ وڌيڪ غير جانبدار مقامي POI7 ٽرپ طور.PDPL 36 خاص طور تي افزائش ٿيل پروٽينن جي نشاندهي ڪئي، جن مان 12 پروٽين (30.0٪ لامين اي سميت) چڱي طرح خصوصيت رکندڙ لامين اي انٽرايٽنگ پروٽينس جيڪي اسٽرنگ ڊيٽابيس پاران بيان ڪيا ويا آهن، بايو آئي ڊي طريقي (122 پروٽين) کان وڌيڪ سيڪڙو سان 28 مان 28، 22.9 %) 7. اسان جو طريقو گهٽ پروٽينن جي نشاندهي ڪئي، ممڪن طور تي محدود ليبلنگ علائقن جي ڪري، جيڪا ممڪن ٿي وئي هئي وڌيڪ فعال سنگل آڪسيجن.GO تجزيي ڏيکاري ٿي ته سڃاڻپ ٿيل پروٽين خاص طور تي نيوڪلوپلازم ۾ واقع هئا (26)، ايٽمي جھلي (10)، ايٽمي جھلي (9)، ۽ ايٽمي سوراخ (5).مجموعي طور تي، اهي ائٽمي-مقامي پروٽينن جو حساب 80٪ افزوده پروٽينن جو آهي، جيڪو وڌيڪ ڏيکاري ٿو PDPL (ضمني شڪل 8a-d).
PDPL جي قابليت قائم ڪرڻ لاءِ آرگنيلز ۾ قربت جي نشانن کي انجام ڏيڻ لاءِ، اسان پوءِ آزمايو ته ڇا PDPL استعمال ٿي سگھي ٿو POI پابند ڀائيوارن جو تجزيو ڪرڻ لاءِ.خاص طور تي، اسان سيٽوسولڪ پروٽينن جي PDPL تجزيي کي بيان ڪرڻ جي ڪوشش ڪئي، جيڪي انهن جي انتهائي متحرڪ طبيعت جي ڪري انهن جي جھلي-مقامي طور تي هم منصب کان وڌيڪ ڏکيو مقصد سمجهي رهيا آهن.bromodomain ۽ extraterminal (BET) پروٽين BRD4 مختلف بيمارين ۾ ان جي اهم ڪردار لاء اسان جي توجه ڪشش ڪئي آهي 35, 36.BRD4 پاران ٺهيل ڪمپليڪس هڪ ٽرانسڪرپشن ڪوڪيڪٽر ۽ هڪ اهم علاج جو هدف آهي.C-myc ۽ Wnt5a ٽرانسپشن فيڪٽرز جي اظهار کي منظم ڪرڻ سان، BRD4 کي ايڪيوٽ مائيلوڊ ليوڪيميا (AML)، ملٽي مائيلوما، برڪيٽ جي لمفوما، کولن ڪينسر ۽ سوزش جي بيمارين جو هڪ اهم تعين ڪندڙ سمجهيو ويندو آهي 37,38.ان کان علاوه، ڪجهه وائرس وائرل ۽ سيلولر ٽرانسپشن کي منظم ڪرڻ لاءِ BRD4 کي نشانو بڻائين ٿا، جهڙوڪ پيپيلوما وائرس، ايڇ آءِ وي، ۽ SARS-CoV-236,39.
PDPL استعمال ڪندي BRD4 رابطي کي نقشي ڪرڻ لاء، اسان miniSOG کي BRD4 جي مختصر N- يا C-ٽرمينل isoform سان گڏ ڪيو.پروٽومڪ نتيجن کي ٻن تعميرن جي وچ ۾ اوورليپ جو هڪ اعلي درجي ظاهر ڪيو ويو آهي (ضمني تصوير. 9a).miniSOG-H2B سان سڃاڻپ ٿيل ايٽمي پروٽوم 77.6٪ پروٽينن جو احاطو ڪري ٿو جيڪو BRD4 سان رابطو ڪري ٿو (ضمني تصوير 9b).ان کان پوء، روشني جا مختلف وقت (2، 5، 10، 20 منٽ) مارڪر ريڊيس کي ترتيب ڏيڻ لاء استعمال ڪيا ويا (تصوير 4a ۽ اضافي ڊيٽا 3).اسان اهو نتيجو ڪريون ٿا ته ننڍي فوٽوپيريڊس تي، PDPL بنيادي طور تي سڌي پابند ڀائيوارن کي ليبل ڪندو، جڏهن ته ڊگھي عرصي ۾ شامل هوندي پروٽينن جي نشاندهي ٿيل مختصر فوٽو ايڪٽيوشن دورن دوران ۽ گڏوگڏ اڻ سڌي طرح مقصد ليبلنگ ڪمپليڪس ۾.حقيقت ۾، اسان کي ويجهي وقت جي پوائنٽن جي وچ ۾ مضبوط اوورليپ مليو (84.6٪ لاء 2 ۽ 5 منٽ؛ 87.7٪ 5 ۽ 10 منٽ لاء؛ 98.7٪ 10 ۽ 20 منٽ لاء) (تصوير 4b ۽ ضمني تصوير. 9c).سڀني تجرباتي گروپن ۾، اسان نه رڳو BRD4 خود ليبلنگ ڏٺا، پر ڪيترائي سڃاتل ھدف جهڙوڪ MED1، CHD8، BICRA، NIPBL، SMC1A، ۽ HMGB1 اسٽرنگ ڊيٽابيس ۾ بيان ڪيل.انهن مقصدن جي آئنڪ طاقت نمائش جي وقت جي تناسب آهي (تصوير 4c ۽ ضمني تصوير. 9d).2 منٽ گروپ ۾ سڃاڻپ ڪيل پروٽينن جي GO تجزيي مان ظاهر ٿيو ته سڃاڻپ ٿيل پروٽينن کي نيوڪيوس ۾ مقامي ڪيو ويو هو ۽ ڪروميٽين ريموڊلنگ ۽ آر اين اي پوليميرس فنڪشن ۾ شامل هئا.پروٽين جي ماليڪيولر فنڪشن ڪروميٽين بائنڊنگ يا ٽرانسپشنل ڪوئڪٽيشن ۾ بهتري ڪئي وئي، BRD4 فنڪشن (تصوير 4d) سان مطابقت رکي ٿي.اسٽرنگ ڊيٽابيس-فعال پروٽين جي وچ ۾ رابطي جي تجزيي ظاهر ڪئي ته BRD4 ۽ HDAC خاندان جي وچ ۾ رابطي واري ڪمپليڪس جهڙوڪ SIN3A، NCOR2، BCOR، ۽ SAP130 (Fig. 4e ۽ ضمني تصوير. 9e) جي وچ ۾ اڻ سڌي طرح رابطي جي پهرين سطح، BRD4 ۽ HDAC بائنڊنگ سان مطابقت ..اضافي طور تي، LC-MS/MS پاران نشاندهي ڪيل نمائندن جا هدف، جن ۾ Sin3A، NSUN2، Fus، ۽ SFPQ شامل آهن، مغربي بلوٽنگ (Fig. 4f) پاران تصديق ڪئي وئي.تازي طور تي، BRD4 جو مختصر isoform ٻڌايو ويو آهي ته مائع-مائع مرحلي جي علحدگيءَ (LLPS) خاصيتن سان گڏ نيوڪلئي ٺاهي.آر اين اي بائنڊنگ پروٽينس Fus ۽ SFPQ مختلف سيلولر عملن جي LLPS ۾ ثالثي ڪن ٿا ۽ انهن کي هتي اڻ رڪارڊ ٿيل BRD4 بائنڊنگ پروٽين طور سڃاتو ويو آهي.BRD4 ۽ SFPQ جي وچ ۾ رابطي جي تصديق ڪئي وئي co-immunoprecipitation (co-IP) تجربن (Figure 4g)، BRD4-ثالث مائع-مائع مرحلي جي علحدگيءَ لاءِ هڪ ٻيو ميکانيزم جو مشورو ڏئي ٿو وڌيڪ تحقيق جي لائق.گڏ ٿي ويا، اهي نتيجا پيش ڪن ٿا ته PDPL هڪ مثالي پليٽ فارم آهي سڃاڻڻ جي لاءِ ڄاڻايل BRD4 رابطي سان گڏوگڏ اڻڄاتل پابند پروٽين.
miniSOG-ثالث BRD4 قربت جي نشانن جي اسڪيمياتي نمائندگي، نمائش جا وقت: 2، 5، 10، ۽ 20 منٽ.b مختلف روشنيءَ جي وقتن تي سڃاڻپ ٿيل پروٽين جي اوورليپ.HEK293T-miniSOG-BRD4 ۾ پروٽينن جي افزودگي جي نشاندهي ڪئي وئي هئي انگن اکرن جي لحاظ کان جهنگلي قسم جي HEK293T جي مقابلي ۾.c آئن جي شدت جڏهن مخصوص نمائش واري وقت دوران اڻ ڄاتل نمائندي ڄاتل BRD4-بائنڊنگ پروٽين جي مقدار کي.n = 3 حياتياتي طور تي آزاد نموني.ڊيٽا پيش ڪيا ويا آهن مطلب ± معياري انحراف.d جين آنٽولوجيڪل تجزيو (GO) پروٽين جي سڃاڻپ 2-منٽ گروپ ۾.پهرين ڏهه GO شرطون درج ٿيل آهن.بلبل GO اصطلاح جي درجي جي مطابق رنگا رنگ آهن، ۽ بلبل جي سائيز هر اصطلاح ۾ مليل پروٽين جي تعداد جي تناسب آهي.E BRD4 سان تعلق رکندڙ پروٽينن جو اسٽرنگ تجزيو.پيلا حلقا سڌو گلو آهن ۽ سرمائي حلقا اڻ سڌي گلو جي پهرين پرت آهن.ڳاڙهي لائينون تجرباتي طور تي طئي ٿيل ڳالهين جي نمائندگي ڪن ٿيون ۽ نيري لائينون پيش ڪيل ڳالهين جي نمائندگي ڪن ٿيون.f LC-MS/MS ۾ سڃاڻپ ڪندڙ BRD4 بائنڊنگ هدفن جي تصديق ڪئي وئي مغربي بلاڪنگ ذريعي.g Co-immunoprecipitation تجربا SFPQ ۽ BRD4 جي وچ ۾ رابطي جي تصديق ڪن ٿا.اهي تجربا آزاديء سان گهٽ ۾ گهٽ ٻه ڀيرا ورجائي رهيا هئا ساڳئي نتيجن سان.خام ڊيٽا خام ڊيٽا فائلن جي صورت ۾ مهيا ڪيل آهن.
غير رجسٽر ٿيل POI سان لاڳاپيل هدفن جي نشاندهي ڪرڻ کان علاوه، اسان اهو سمجهون ٿا ته PDPL انزايمز لاءِ ذيلي ذخيري جي سڃاڻپ لاءِ مناسب هوندو، جنهن کي غير رجسٽرڊ سبسٽرن کي تشريح ڪرڻ لاءِ وڏي ڪمپليڪس ۾ اڻ سڌي طرح پابند پروٽين جي خاصيت جي ضرورت هوندي.پارڪن (PARK2 پاران انڪوڊ ٿيل) هڪ E3 ligase آهي ۽ پارڪن ۾ ميوٽيشنز آٽوسومل ريسيسيو نوجوان پارڪنسن جي بيماري (AR-JP) 42 جو سبب بڻجن ٿيون.ان کان علاوه، پارڪن کي mitophagy (mitochondrial autophagy) ۽ رد عمل واري آڪسيجن جي نسلن کي ختم ڪرڻ لاء ضروري قرار ڏنو ويو آهي.جيتوڻيڪ، جيتوڻيڪ پارڪن جي ڪيترن ئي ذيلي ذخيري جي نشاندهي ڪئي وئي آهي، هن بيماري ۾ پارڪن جو ڪردار واضح ناهي.ان جي غير معمولي ذيلي ذخيري کي بيان ڪرڻ لاء، PDPL کي miniSOG شامل ڪندي آزمايو ويو پارڪن جي N- يا سي-ٽرمينس ۾.سيلز کي ڪاربنيل سائانائيڊ پروٽون ٽرانسپورٽر ايم-ڪلوروفينيل هائيڊرازون (CCCP) سان علاج ڪيو ويو ته جيئن پارڪن کي PINK1-پارڪين رستي ذريعي چالو ڪيو وڃي.اسان جي BRD4 PDPL نتيجن جي مقابلي ۾، پارڪن اين ٽرمينس فيوزن کي ٽارگيٽ پروٽين جو هڪ وڏو سيٽ ظاهر ڪيو، جيتوڻيڪ اهو سي-ٽرمينس جو وڏو حصو ڍڪي ٿو (210 مان 177) (شڪل 5a، b ۽ ضمني ڊيٽا 4).نتيجو رپورٽن سان مطابقت رکي ٿو ته N-terminal tags aberrantly activate Parkin44.حيرت انگيز طور تي، اسان جي ڊيٽا ۾ صرف 18 اوورليپنگ پروٽين موجود هئا Parkin43 لاءِ شايع ٿيل AP-MS نتيجن سان، ممڪن طور تي سيل لائنن ۽ پروٽومڪ ڪم فلوز جي وچ ۾ فرق جي ڪري.ان کان علاوه چار سڃاتل پروٽين (ARDM1، HSPA8، PSMD14، ۽ PSMC3) ٻن طريقن سان سڃاڻپ (Fig. 5c) 43.LC-MS/MS جي نتيجن کي وڌيڪ صحيح ڪرڻ لاء، PDPL علاج ۽ بعد ۾ مغربي ڦوٽو استعمال ڪيو ويو HEK293T والدين سيل جي امتحان ۽ مستحڪم اين ٽرمينل پارڪين لائن جي نتيجن جي مقابلي لاء.اڳي اڻڄاتل ھدف CDK2، DUT، CTBP1، ۽ PSMC4 ھڪڙي سڃاتل بائنر، DNAJB1 (Fig. 5d) سان آزمائيا ويا.
HEK293T سيلز ۾ پارڪن سان لهه وچڙ ڪندڙ پروٽين جو آتش فشاں پلاٽ miniSOG سان گڏ پارڪن جي N- يا C-ٽرمينس سان فيوز ٿيل آهي (n = 3 آزاد حياتياتي تجربا).ٻن دم واري شاگردن جي ٽي ٽيسٽ آتش فشاني پلاٽن تي استعمال ڪئي وئي.HEK293T هڪ منفي ڪنٽرول طور استعمال ڪيو ويو. خاص طور تي تبديل ٿيل پروٽين ڳاڙهي ۾ نمايان ٿيل آهن (p <0.05 ۽> 2-fold آئن شدت فرق). خاص طور تي تبديل ٿيل پروٽين ڳاڙهي ۾ نمايان ٿيل آهن (p <0.05 ۽> 2-fold آئن شدت فرق). Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и >2-кратная разница в интенсивности ионов). خاص طور تي تبديل ٿيل پروٽين ڳاڙهي ۾ نمايان ٿيل آهن (p <0.05 ۽> آئن جي شدت ۾ 2-گنا فرق).显着变化的蛋白质以红色突出显示（p <0.05 和> 2 倍离子强度差异）.显着变化的蛋白质以红色突出显示（p <0.05和>2 Значительно измененные белки выделены красным цветом (p < 0,05 и > 2-кратная разница в ионной силе). خاص طور تي تبديل ٿيل پروٽينن کي ڳاڙهي رنگ ۾ نمايان ڪيو ويو آهي (p <0.05 ۽ > 2-fold فرق آئنڪ طاقت ۾).لاڳاپيل پروٽين HEK293T-miniSOG لاءِ اھم آھن پر HEK293T لاءِ اھم ناھن سائي ۾ ڏيکاريا ويا آھن.b وين ڊاگرام N-ٽرمينل ۽ C-ٽرمينل تعميرات جي وچ ۾ اوورليپنگ پروٽين ڏيکاريندي.اين ٽرمينل ٽيگ غير معمولي طور تي پارڪن کي چالو ڪري سگھن ٿا ۽ نتيجي ۾ وڌيڪ سڃاتل پروٽينن جي نتيجي ۾.c وين ڊراگرام PDPL ۽ AP-MS جي وچ ۾ اوورليپنگ پروٽين ڏيکاريندي.ڄاڻايل رابطي وارا درج ڪيا ويا آهن، جن ۾ 4 مان 18 اوورليپنگ پروٽين ۽ 11 مان 159 پروٽينس خاص طور تي PDPL ۾ سڃاتل آهن.d LC-MS/MS پاران سڃاڻپ ڪيل نمائندن جي ھدف جي تصديق ڪئي وئي مغربي بلٽنگ پاران.e Ssu72 ۽ SNW1 جي سڃاڻپ غير رجسٽرڊ پارڪن سبسٽراٽس طور ڪئي وئي.اهي FLAG-ٽيگ ٿيل پروٽين پلازميڊس HEK293T ۽ HEK293T-Parkin-miniSOG ۾ تبديل ڪيا ويا جنهن بعد مختلف وقتن تي CCCP علاج ڪيو ويو.پارڪن اوور ايڪسپريشن لائن ۾ تباهي وڌيڪ واضح هئي.f پروٽيزوم انبائيٽٽر MG132 استعمال ڪندي، اها تصديق ڪئي وئي ته Ssu72 ۽ SNW1 جي تباهي واري عمل کي پروٽيزوم-يوبيڪيٽيشن ذريعي وچولي آهي.اهي تجربا آزاديء سان گهٽ ۾ گهٽ ٻه ڀيرا ورجائي رهيا هئا ساڳئي نتيجن سان.خام ڊيٽا خام ڊيٽا فائلن جي صورت ۾ مهيا ڪيل آهن.
خاص طور تي، PDPL پاران سڃاڻپ ڪيل پروٽينن ۾ پارڪن-بائنڊنگ پروٽين ۽ انهن جي ذيلي ذيلي ذخيرو شامل ٿيڻ گهرجي.غير رجسٽرڊ پارڪن سبسٽرن کي ڳولڻ لاءِ، اسان ست سڃاتل پروٽينس (PUF60، PSPC1، UCHL3، PPP1R8، CACYBP، Ssu72 ۽ SNW1) چونڊيا ۽ انهن جين کي عام HEK293T ڏانهن بي نقاب ڪرڻ لاءِ منتقل ٿيل پلازميڊس ۽ miniSOG-Parkin's 2CCTCPed جي پيروي ڪندي miniSOG-Parkin's Treatment جي پيروي ڪئي.Ssu72 ۽ SNW1 پروٽين جي سطحن کي مستحڪم miniSOG-پارڪين لائن (Fig. 5e) ۾ خاص طور تي گھٽايو ويو.12 ڪلاڪن تائين CCCP سان علاج ڪرڻ جي نتيجي ۾ ٻنهي ذيلي ذخيري جي تمام گهڻي تباهي ٿي.تحقيق ڪرڻ لاءِ ته ڇا Ssu72 ۽ SNW1 جي تنزلي کي پروٽيزوم-يوبيڪيٽينشن ذريعي منظم ڪيو ويو آهي، پروٽيزوم انابيٽر MG132 شامل ڪيو ويو پروٽيزوم سرگرمي کي روڪڻ لاءِ، ۽ حقيقت ۾ اسان ڏٺو ته انهن جي تباهي واري عمل کي روڪيو ويو هو (تصوير 5f).اضافي غير ذيلي هدفن جي تصديق ڪئي وئي پارڪين انٽرڪٽرز جي طور تي مغربي بلٽنگ استعمال ڪندي (ضمني شڪل 10)، جيڪي LC-MS/MS سان مسلسل نتيجا ڏيکاريا.نتيجي ۾، PDPL ڪم فلو جي انضمام سان ٽارگيٽ پروٽين جي منتقلي جي تصديق جي اجازت ڏئي ٿي غير رجسٽر ٿيل E3 ligase substrates جي سڃاڻپ.
اسان ترقي ڪئي آهي هڪ عام قربت جي نشاندهي واري پليٽ فارم جيڪا توهان کي سڃاڻڻ جي اجازت ڏئي ٿي خلا ۽ وقت جي وچ ۾ رابطي واري POIs.پليٽ فارم miniSOG photosensitizer پروٽين تي ٻڌل آهي، جيڪو صرف 12 kDa آهي، بالغ APEX2 اينزيم (27 kDa) جي اڌ کان گهٽ ۽ TurboID (35 kDa) جي هڪ ٽيون سائيز.ننڍي سائيز کي تمام گهڻو وڌائڻ گهرجي ايپليڪيشنن جي حد تائين ننڍي پروٽين جي وچ ۾ رابطي جي مطالعي لاء.اضافي فوٽوسينسائٽيزر جي وڌيڪ ڳولا، ڇا جينياتي طور تي انڪوڊ ٿيل پروٽين يا ننڍڙا ماليڪيولز، سنگلٽ آڪسيجن جي مقدار جي پيداوار کي وڌائڻ ۽ هن طريقي جي حساسيت کي وڌائڻ جي ضرورت آهي.miniSOG جي موجوده ورزن لاءِ، قربت جي نشانن کي چالو ڪرڻ لاءِ نيري روشني استعمال ڪندي اعليٰ عارضي ريزوليشن حاصل ڪري سگھجي ٿي.ان کان علاوه، گهڻي نمائش واري وقت سنگلٽ آڪسيجن جو هڪ وڏو ”بادل“ جاري ڪيو، جنهن جي نتيجي ۾ وڌيڪ ڊسٽل هسٽيڊائن جي باقيات ۾ ترميم، ليبلنگ ريڊيس ۾ اضافو، ۽ PDPL فضائي ريزوليوشن کي ٺيڪ ڪرڻ جي صلاحيت.اسان سگنل کان پس منظر جي تناسب کي وڌائڻ لاءِ ست ڪيميائي جاچ پڻ آزمائيون ۽ ان طريقي جي پويان ماليڪيولر ميکانيزم جي ڳولا ڪئي.TOP-ABPP ڪم فلو گڏيل طور تي غيرجانبدار کليل ڳولا سان گڏ تصديق ڪئي وئي آهي ته تبديليون صرف هسٽائيڊائنز ۾ ٿينديون آهن ۽ هسٽائيڊائن جي تبديلين لاءِ ڪو به مسلسل مائڪرو ماحوليات نه ڏٺو ويو، سواءِ لوپ علائقي ۾ هسٽائيڊائنز جي وچولي ترجيح جي.
PDPL پڻ استعمال ڪيو ويو آھي ذيلي سيلولر پروٽومز کي خاص ڪرڻ لاءِ پروٽوم جي خصوصيت ۽ ڪوريج گھٽ ۾ گھٽ ٻين قربت واري ليبلنگ ۽ آرگنيل مخصوص ڪيميائي جاچ طريقن جي مقابلي ۾.قربت جي نشانن کي پڻ ڪاميابيءَ سان استعمال ڪيو ويو آهي مٿاڇري، ليسوسومل، ۽ secretome سان لاڳاپيل پروٽومز 46,47 کي خاص ڪرڻ لاءِ.اسان يقين رکون ٿا ته PDPL انهن ذيلي سيلولر آرگنيلز سان گڏ هوندو.ان کان علاوه، اسان پي ڊي پي ايل کي سيٽوسولڪ پروٽين بائنڊنگ جي مقصدن جي نشاندهي ڪندي چيلينج ڪيو جيڪي جھلي پابند پروٽينن کان وڌيڪ پيچيده آھن انھن جي متحرڪ ملڪيت جي ڪري ۽ وڌيڪ عارضي رابطي ۾ شامل ٿيڻ جي ڪري.PDPL ٻن پروٽينن تي لاڳو ڪيو ويو، ٽرانسپشنل ڪوڪيڪٽر BRD4 ۽ بيماري سان لاڳاپيل ligase E3 Parkin.اهي ٻه پروٽين نه رڳو انهن جي بنيادي حياتياتي ڪمن لاءِ چونڊيا ويا هئا، پر انهن جي ڪلينڪل لاڳاپن ۽ علاج جي صلاحيت لاءِ پڻ.انهن ٻن POIs لاءِ، سڃاتل پابند ڀائيوار ۽ گڏوگڏ غير رجسٽرڊ هدفن جي نشاندهي ڪئي وئي.خاص طور تي، مرحلو علحدگيء سان لاڳاپيل پروٽين SFPQ Co-IP پاران تصديق ڪئي وئي، جيڪا شايد هڪ نئين ميکانيزم جي نشاندهي ڪري ٿي جنهن جي ذريعي BRD4 (مختصر isoform) LLPS کي منظم ڪري ٿو.ساڳئي وقت، اسان يقين رکون ٿا ته پارڪن جي ذيلي ذخيري جي سڃاڻپ هڪ منظر آهي جنهن ۾ اڻ سڌي طرح چپڪندڙن جي سڃاڻپ گهربل آهي.اسان ٻن اڻڄاتل پارڪن سبسٽرن جي نشاندهي ڪئي ۽ ان جي تباهي جي تصديق ڪئي ubiquitination-proteasome pathway سان.تازي طور تي، هڪ ميڪانيزم تي ٻڌل ٽريپنگ حڪمت عملي ٺاهي وئي آهي ته هائيڊروليز سبسٽريٽ کي ڳولڻ لاء انهن کي اينزيميمس سان ڇڪڻ سان.جيتوڻيڪ اهو هڪ تمام طاقتور طريقو آهي، اهو وڏي ڪمپليڪس جي ٺهڻ ۾ ملوث ذيلي ذخيرو جي تجزيي لاء مناسب ناهي ۽ انزائيم ۽ سبسٽٽ جي وچ ۾ covalent بانڊ جي ٺهڻ جي ضرورت آهي.اسان اميد رکون ٿا ته پي ڊي پي ايل کي وڌايو وڃي ٿو ٻين پروٽينن ڪمپليڪس ۽ اينزيم خاندانن جي مطالعي لاء، جهڙوڪ deubiquitinase ۽ metalloprotease خاندان.
miniSOG جو هڪ نئون روپ، جنهن کي SOPP3 سڏيو ويندو آهي، ترقي ڪئي وئي آهي سنگلٽ آڪسيجن جي بهتر پيداوار سان.اسان miniSOG جو SOPP3 سان مقابلو ڪيو ۽ بهتر نشانن جي ڪارڪردگي ڏٺي، جيتوڻيڪ سگنل کان شور جي نسبت ۾ ڪا تبديلي نه رهي (ضمني تصوير 11).اسان اهو تصور ڪيو ته SOPP3 جي اصلاح (مثال طور، هدايت ٿيل ارتقاء جي ذريعي) وڌيڪ ڪارائتو فوٽوسينسائيزر پروٽينن کي ڏسندي جيڪا ننڍي روشني جي وقت جي ضرورت هوندي آهي ۽ اهڙيء طرح وڌيڪ متحرڪ سيلولر پروسيس کي پڪڙڻ جي اجازت ڏين ٿا.خاص طور تي، PDPL جو موجوده نسخو سيلولر ماحول تائين محدود آهي ڇو ته ان کي نيري روشني جي روشني جي ضرورت آهي ۽ گہرے بافتن ۾ داخل نه ٿي سگهي.هي خصوصيت ان جي استعمال کي جانورن جي ماڊل مطالعي ۾ روڪي ٿو.بهرحال، PDPL سان optogenetics جو ميلاپ جانورن جي تحقيق لاءِ موقعو فراهم ڪري سگهي ٿو، خاص طور تي دماغ ۾.ان کان علاوه، ٻيا انجنيئر انفراريڊ ڦوٽو سينسائيزر پڻ هن حد کي هٽائي ڇڏيندا آهن.هن وقت تحقيق هن علائقي ۾ جاري آهي.
HEK293T سيل لائن ATCC (CRL-3216) کان حاصل ڪئي وئي.سيل لائن مائڪوپلاسما انفيڪشن لاءِ منفي آزمائي ڪئي وئي ۽ DMEM (Thermo, #C11995500BT) ۾ 10% fetal bovine serum (FBS, Vistech, #SE100-B) ۽ 1% penicillin/streptomycin (Hyclone, #SV3) سان گڏ ڪئي وئي.۾ وڌيو
3-Aminophenylene (نمونہ 3) ۽ (4-ethynylphenyl) methanamine (نمونہ 4) Bidepharm کان خريد ڪيا ويا.پروپيلامائن (تحقيق 2) انرجي ڪيميڪل مان خريد ڪيو ويو.N-(2-Aminophenyl) pent-4-ynamide (probe 1) شايع ٿيل طريقن جي مطابق ٺهيل هئي.
ضمني جدول 1 هن مطالعي ۾ استعمال ٿيل جينياتي تعميرات کي لسٽ ڪري ٿو.miniSOG ۽ KillerRed تسلسل P. Zou (Peking University) کان تحفي پلازميڊ مان ڪلون ڪيا ويا.mitochondrial matrix ھدف ڪرڻ وارو سلسلو COX4 جي 23 N-ٽرمينل امينو اسيد مان اخذ ڪيو ويو ۽ گبسن اسيمبلي (Beyotime, #D7010S) استعمال ڪندي ڏيکاريل ویکٹرز ۾ ڪلون ڪيو ويو.Endoplasmic reticulum جي جھلي ۽ مرڪز کي نشانو بڻائڻ لاءِ، SEC61B انساني ڊي اين اي (NM_006808.3) (NEB، #M0491L) پي سي آر پاران HEK293T سيلز جي سي ڊي اين اي لئبريري مان وڌايو ويو، ۽ H2B ڊي اين اي (ڊانٽ ڪيل ڊي. لن، بي شنزين پاران ڏنل) ۽ ڪلون، جيئن مٿي ڄاڻايل آهي.جيستائين ٻي صورت ۾ اشارو نه ڪيو ويو، ٻين پروٽين جين کي منتقلي ۽ مستحڪم سيل لائينن جي تعمير لاء استعمال ڪيو ويو PCR HEK293T سيل سي ڊي اين اي لائبريري مان وڌايو ويو.G3S (GGGS) ۽ G4S (GGGGS) بيت پروٽين ۽ miniSOG جي وچ ۾ لنڪرز طور استعمال ڪيا ويا.هڪ V5 ايپيٽوپ ٽيگ (GKPIPNPLLGLDST) انهن فيوزن تعميرات ۾ شامل ڪيو ويو.ٿلهي جانورن ۾ اظهار لاءِ ۽ هڪ مستحڪم سيل لائن قائم ڪرڻ لاءِ، miniSOG فيوزن جي تعمير کي pLX304 lentiviral vector ۾ subcloned ڪيو ويو.بيڪٽيريا جي اظهار لاءِ، miniSOG کي C-terminus تي 6xHis ليبل ٿيل pET21a ویکٹر ۾ ڪلون ڪيو ويو.
HEK293T سيلز کي 2.0 x 105 سيلز في کوھ ۾ ڇھ کنيل پليٽن ۾ سيڊ ڪيو ويو ۽ 24 ڪلاڪن کان پوءِ ريڪوبيننٽ lentiviral plasmids (2.4 μg pLX304) ۽ وائرل پيڪنگنگ پلاسميڊس (1.5 μg psPAX2 ۽ 1.2 μg psPAX2 ۽ 1.2 LiBpoG08 استعمال ڪندي) ، #C0533)، اٽڪل 80٪ فيوزن.رات جي منتقلي کان پوء، وچولي تبديل ڪئي وئي ۽ ٻئي 24 ڪلاڪن لاء incubated.وائرس جو مجموعو 24، 48 ۽ 72 ڪلاڪن کانپوءِ ڪيو ويو.ٽارگيٽ سيل لائنن جي انفيڪشن کان اڳ، وائرل ميڊيم کي 0.8 μm فلٽر ذريعي فلٽر ڪيو ويو (Merck, #millex-GP) ۽ polybrene (Solarbio, #H8761) 8 μg/ml جي ڪنسنٽريشن ۾ شامل ڪيو ويو.24 ڪلاڪن کان پوء، سيلز کي وچولي تبديل ڪندي بحال ڪرڻ جي اجازت ڏني وئي.سيلز کي 5 μg/ml blasticidin (Solarbio، #3513-03-9) استعمال ڪندي پهرين ٽن پاسن لاءِ هيٺين سخت چونڊ جي طور تي چونڊيو ويو.ان کان پوء استعمال ڪيو 20 μg / ml ايندڙ ٽن پاسن لاء وڌيڪ سخت ريگيمن جي طور تي.
سيلز 12-ڪھڙي چيمبرن (Ibidi، #81201) ۾ لڳ ڀڳ 20,000 سيلز في ڪھاڻي جي کثافت تي ٻج ڪيا ويا.HEK293T سيلن جي چپن کي بهتر ڪرڻ لاءِ، 50 µg/ml fibronectin (Corning, #356008) شامل ڪريو فاسفيٽ بفر ٿيل لوڻ (PBS, Sangon, #B640435) ۾ 37°C تي.چيمبرن کي 1 ڪلاڪ لاء تيار ڪيو ويو ۽ پوء PBS سان هٽايو ويو.24 ڪلاڪ کان پوءِ، سيلز کي PBS سان هڪ ڀيرو ڌويو ويو، 1 ايم ايم پروب 3 سان تازو هينڪس جي متوازن لوڻ جي حل (HBSS, Gibco, #14025092) ۾ 1 h لاءِ 37 ° C تي، ۽ پوءِ نيري LED (460 nm) سان انڪيوب ڪيو ويو. ).) 10 منٽ لاء ڪمري جي حرارت تي شعاع ڪيو ويو.ان کان پوءِ، سيلز کي PBS سان ٻه ڀيرا ڌويو ويو ۽ PBS (Sangon, #E672002) ۾ 4% formaldehyde سان 15 منٽن لاءِ ڪمري جي حرارت تي لڳايو ويو.اضافي formaldehyde مقرر ٿيل سيلز مان ڪڍيو ويو، ٽي دفعا PBS سان ڌوئڻ سان.سيلز کي پوءِ 0.5٪ Triton X-100 (Sangon, #A600198) سان PBS ۾ گھمايو ويو ۽ 3 ڀيرا PBS سان ڌويو ويو.پوءِ چيمبر کي هٽايو ۽ هر نموني ۾ شامل ڪريو 25 µl هڪ ڪلڪ جي رد عمل جو مرکب جنهن ۾ 50 µM Cy3-azide (Aladdin, #C196720), 2 mM CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 mM BTTAA (Confluore, #BDJ-4) ۽ 0.5 mg/ml sodium ascorbate (Aladdin, no. S105024) ۽ ڪمري جي حرارت تي 30 منٽن لاءِ انڪيوب ڪيو ويو.هڪ سنيپ ردعمل کان پوء، سيلز کي ڇهه ڀيرا ڌوڪيو ويو PBS سان 0.05٪ Tween-20 (Sangon, #A600560) (PBST) ۽ پوء بلاڪ ڪيو ويو 5٪ BSA (Abcone, #B24726) سان PBST ۾ 30 منٽن لاء ڪمري جي حرارت تي.
ڪولوڪلائيزيشن اموناسٽيننگ لاءِ، سيلز کي بنيادي اينٽي باڊيز سان لڳايو ويو هو ظاهر ڪيل شرطن مطابق: ماؤس اينٽي V5 ٽيگ mAb (1:500, CST, #80076), خرگوش مخالف Hsp60 mAb (1:1000), ABclonal, #A0564), rabbit polyclonal anti calnexin antibody (1:500, Abcam, #ab22595) يا خرگوش اينٽي لامين A/C مونوڪلونل اينٽي باڊي (1:500; CST, #2032) رات جو 4 °C تي.PBST سان 3 ڀيرا ڌوئڻ کان پوءِ، سيلز ثانوي اينٽي باڊيز سان پکڙجي ويا: بکري اينٽي ريبيٽ Alexa Fluor 488 (Thermo, #A11034) diluted 1:1000, goat anti-mouse Alexa Fluor 594 (CST, #8889) 1:100.dilution 30 منٽن لاء ڪمري جي حرارت تي dilute.سيلز وري 3 ڀيرا PBST سان ڌويا ويا ۽ DAPI (Thermo, #D1306) سان PBS ۾ 10 منٽن لاءِ ڪمري جي حرارت تي ڌوئي ويا.PBS سان 3 ڌوئڻ کان پوء، سيلز کي سيل ڪيو ويو 50٪ گليسرول (سنگون، #A600232) PBS ۾ تصويري لاء.Immunofluorescent تصويرون هڪ ZEISS LSM 900 Airyscan2 confocal microscope ۽ ZNE 3.5 سافٽ ويئر استعمال ڪندي حاصل ڪيون ويون.
سنگلٽ آڪسيجن فلورسنٽ اميجنگ لاءِ، هينڪس هيپيس بفر (DOJINDO، #MT05) ۾ 100 nM Si-DMA شامل ڪرڻ کان پهريان سيلز ٻه ڀيرا هينڪس هيپيس بفر سان ڌوئي ويا.روشنيءَ جي نمائش کان پوءِ، سيلز کي CO2 انڪيوبيٽر ۾ 37 ° C تي 45 منٽن لاءِ انڪيوب ڪيو ويو.سيلز وري هينڪس جي HEPES بفر سان ٻه ڀيرا ڌويا ويا ۽ هينڪس جي HEPES بفر ۾ Hoechst سان 10 منٽن لاءِ ڪمري جي گرمي پد تي رکيا ويا ۽ ZEISS LSM 900 ڪنفوڪل مائڪرو اسڪوپ استعمال ڪندي ڏسڻ ۾ آيا.، #M36008) HBSS بفر ۾ ڪلسيم ۽ ميگنيشيم تي مشتمل آهي.روشني يا doxorubicin (MCE, #HY-15142A) جي نمائش کان پوءِ، سيلز کي CO2 انڪيوبيٽر ۾ 37 ° C. تي 10 منٽن لاءِ انڪيوب ڪيو ويو، HBSS بفر سان ٻه ڀيرا ڌويو ويو، ۽ HBSS بفر ۾ Hoechst سان ڪمري جي حرارت تي incubated.منٽ.Doxorubicin استعمال ڪيو ويو مثبت تحقيق ڪنٽرول جي طور تي جتي سيلز کي HBSS ۾ 20 μM doxorubicin سان علاج ڪيو ويو جنهن ۾ 1٪ BSA 30 منٽ لاءِ.Immunofluorescent تصويرون Zeiss LSM 900 confocal microscope استعمال ڪندي حاصل ڪيون ويون.
HEK293T سيلز مستقل طور تي mito-miniSOG کي ظاهر ڪن ٿا تقريبن 30٪ جي کثافت تي 15 سينٽي وينجن ۾.48 ڪلاڪن کان پوء، جڏهن ~ 80٪ سنگم تي پهچي ويو، سيلز هڪ ڀيرو PBS سان ڌويا ويا، 1 ايم ايم پروب 3 سان تازي HBSS بفر ۾ 1 ڪلاڪ لاء 37 ° C تي ۽ پوء ڪمري ۾ 10 منٽن لاء نيري LED سان روشني ڪئي وئي. گرمي پد..ان کان پوء، سيلز PBS سان ٻه ڀيرا ڌوئي ويا، اسڪريپ ٿيل ۽ برفاني سرد ​​PBS بفر ۾ ٻيهر بحال ڪيا ويا جن ۾ EDTA-free protease inhibitors (MCE، #HY-K0011).سيلز کي 1 منٽ (1 سيڪنڊ آن ۽ 1 سيڪنڊ آف 35٪ طول و عرض تي) لاءِ ٽپ کي سونيڪ ڪرڻ سان ليس ڪيو ويو.نتيجي ۾ مليل مرکب 15,871 xg تي 10 منٽ لاءِ 4 ° C تي centrifuged ڪيو ويو ملبي کي هٽائڻ لاءِ، ۽ سپرنيٽنٽ ڪنسنٽريشن کي 4 mg/mL تي ترتيب ڏنو ويو BCA پروٽين جي آسي کٽ (Beyotime, #P0009).مٿي ڏنل 1 ml lysate کي 0.1 mM photodegradable biotin azide سان گڏ ڪريو (Confluore, #BBBD-14)، 1 mM TCEP (Sangon, #A600974), 0.1 mM TBTA ligand (Aladdin, #T162437)، ۽ 1 mM Cuubator ھيٺان 4M. ڪمري جي حرارت تي 1 ڪلاڪ لاء گردش.ترت رد عمل کان پوءِ، 10 مليل شيشي جي شيشي ۾ اڳ ۾ مليل حل (MeOH:CHCl3:H2O = 4 ml:1 ml:3 ml) ۾ مرکب شامل ڪريو.نمونن کي ملايو ويو ۽ 4500 گرام تي 10 منٽن لاءِ ڪمري جي حرارت تي سينٽرفيوز ڪيو ويو.هيٺين ۽ مٿئين حل کي رد ڪيو ويو، 4 ° C تي 5 منٽ لاء 15871xg تي سينٽرفيوج ڪيو ويو ۽ 1 ml ميٿانول سان ٻه ڀيرا ڌوئي ويو.25 ايم ايم امونيم بائڪ ڪاربونيٽ (ABC, Aladdin, no. A110539) ۾ 1 ml 8 M urea (Aladdin, No. U111902) ملايو وڃي ته جيئن ورن کي ٽوڙڻ لاءِ.نمونن کي 10 ايم ايم ڊيٿيوٿريتول (سانگون، #A100281 25 ايم ايم ABC ۾) سان 40 منٽن لاءِ 55 ° سي تي ٻيهر ترتيب ڏنو ويو ۽ ان کان پوءِ اونداهي ۾ ڪمري جي حرارت تي 15 ايم ايم تازو آئيوڊواسيٽامائيڊ (سانگون، #A600539) شامل ڪيو ويو.30 منٽن اندر Alkylation..ردعمل کي روڪڻ لاء هڪ اضافي 5 ايم ايم ڊيٿيوٿريتول شامل ڪيو ويو.هر نموني لاءِ لڳ ڀڳ 100 µl NeutrAvidin agarose beads (Thermo, #29202) تيار ڪريو 1 ml PBS سان 3 ڀيرا ڌوئي.مٿي ڏنل پروٽوم محلول کي 5 ml PBS سان ملايو ويو ۽ اڳ ڌوتل NeutrAvidin agarose beads سان 4 ڪلاڪن لاءِ ڪمري جي گرمي پد تي رکيل هو.ان کان پوءِ موتي کي 3 ڀيرا ڌويو ويو 5 ml PBS سان جنهن ۾ 0.2% SDS (Sangon, #A600485)، 3 ڀيرا 5 ml PBS سان 1M يوريا، 3 ڀيرا 5 ml ddH2O سان ڌويا ويا.موتي وري سينٽريفيوگيشن ذريعي کٽيا ويا ۽ 200 μl 25 mM ABC ۾ ٻيهر بحال ڪيا ويا جن ۾ 1 M يوريا، 1 mM CaCl 2 (Macklin, #C805228) ۽ 20 ng/μl trypsin (Promega, #V5280).رات جو 37 ° C تي گردش سان Trypsinize.فارمڪ ايسڊ (Thermo, # A117-50) شامل ڪندي رد عمل کي روڪيو ويو جيستائين پي ايڇ 2-3 تائين پهچي.موتين کي 3 ڀيرا ڌويو ويو 1 ml PBS سان جنهن ۾ 0.2% SDS آهي، 3 ڀيرا 1 ml PBS جنهن ۾ 1 M يوريا شامل آهي، ۽ پوءِ 3 ڀيرا 1 ml distilled water سان.تبديل ٿيل پيپٽائڊس لائٽ ليسس (365 nm) ذريعي 90 منٽ لاءِ 200 μl 70٪ MeOH استعمال ڪندي ڇڏيا ويا.centrifugation کان پوء، supernatant گڏ ڪيو ويو.پوءِ موتي کي 100 μl جي 70٪ MeOH سان هڪ ڀيرو ڌويو ويو ۽ سپرنٽينٽس کي گڏ ڪيو ويو.نمونن کي اسپيڊ ويڪ ويڪيوم ڪنسٽرٽر ۾ خشڪ ڪيو ويو ۽ تجزيو تائين -20 ° C تي ذخيرو ڪيو ويو.
سنگلٽ آڪسيجن تبديل ٿيل پيپٽائڊس جي سڃاڻپ ۽ مقدار کي طئي ڪرڻ لاءِ، نمونن کي 0.1٪ فارمڪ ايسڊ ۾ ٻيهر حل ڪيو ويو ۽ 1 μg پيپٽائيڊس جو تجزيو ڪيو ويو هڪ Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer سان ليس نانو ESI ذريعن سان وينڊر سافٽ ويئر 4.نموني الڳ ڪيا ويا 75 µm × 15 cm اندروني طور تي ڀريل ڪيپيلري ڪالمن تي 3 µm C18 مواد سان (ReproSil-pur, #r13.b9.) ۽ EASY-nLC 1200 UHPLC سسٽم (Thermo) سان ڳنڍيل هئا.پيپٽائيڊس کي لڪير 95 منٽ گريڊينٽ ڪروميٽوگرافيءَ ذريعي 8٪ سالوينٽ B کان 50٪ سالوينٽ B تائين (A = 0.1٪ formic acid پاڻيءَ ۾، B = 0.1% formic acid in 80% acetonitrile)، پوءِ لڪيريءَ سان 98٪ B منٽ تائين وڌايو ويو. 6 منٽ ۾ 300 اين ايل / منٽ جي وهڪري جي شرح تي.Orbitrap Fusion Lumos ڊيٽا گڏ ڪري ٿو متبادل طور تي مڪمل MS اسڪين ۽ MS2 اسڪين جي وچ ۾ ڊيٽا جي لحاظ کان.اسپٽرنگ وولٹیج 2.1 kV تي مقرر ڪيو ويو ۽ آئن ٽرانسپورٽ ڪيپليري جو گرمي پد 320 ° C هو.MS اسپيڪٽرا (350-2000 m/z) گڏ ڪيا ويا 120,000 جي ريزوليوشن سان، AGC 4 × 105، ۽ وڌ ۾ وڌ ان پٽ ٽائيم 150 ms.10 سڀ کان وڌيڪ عام ضرب چارج ٿيل اڳڪٿيون هر مڪمل اسڪين ۾ HCD استعمال ڪندي 30٪ جي معمولي ٽڪرائي توانائي سان، 1.6 m/z جي هڪ کواڊرپول آئسوليشن ونڊو، ۽ 30,000 جي ريزوليوشن سيٽنگ سان ٽڪرائجي ويون.5×104 ۽ وڌ ۾ وڌ ان پٽ ٽائيم 150 ms استعمال ڪندي ٽينڊم ماس اسپيڪٽروميٽري لاءِ AGC ٽارگيٽ.متحرڪ استثنا 30 سيڪنڊن تي مقرر ڪيو ويو آهي. غير تفويض ٿيل آئنز يا جيڪي 1+ ۽> 7+ جي چارج سان MS/MS لاءِ رد ڪيا ويا. غير تفويض ٿيل آئنز يا جيڪي 1+ ۽> 7+ جي چارج سان MS/MS لاءِ رد ڪيا ويا. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. 1+ ۽>7+ جي چارج سان غير ترتيب ڏنل آئنز يا آئنز MS/MS لاءِ رد ڪيا ويا.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 离子被拒绝用于MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 离子被拒绝用于MS/MS. Неуказанные ионы и ионы с зарядами 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. 1+ ۽>7+ جي چارجن سان اڻ ڄاڻايل آئنز يا آئنز MS/MS لاءِ رد ڪيا ويا.
خام ڊيٽا MSFragger جي بنياد تي FragPipe ڪمپيوٽنگ پليٽ فارم استعمال ڪندي پروسيس ڪئي وئي آهي.ماس تعصب ۽ ملندڙ امينو اسيدز کي -150 کان 500 Da جي اڳڀرائي ماس رواداري سان اوپن سرچ الگورٿم استعمال ڪندي طئي ڪيو ويو.تبديل ٿيل پيپٽائڊس کي پوءِ هسٽائيڊائن جي تبديلين کي استعمال ڪندي سڃاڻپ ڪئي وئي +229.0964 ۽ +247.1069 دا PD ۾ ماس حاصلات سان (پروٽوم دريافت ڪندڙ 2.5، Thermo).
فيوز ٿيل miniSOG جين کي مستحڪم طور تي ظاهر ڪندڙ سيلز 6 سينٽي وينجن ۾ پلاٽ ڪيا ويا.~ 80٪ سنگم تي پهچڻ تي، سيلز کي HBSS (Gibco، #14025092) سان هڪ ڀيرو ڌوئي ويا، پوءِ HBSS ۾ ڪيميائي جاچ سان 1 ڪلاڪ لاءِ 37°C تي ڌويا ويا ۽ نيري روشنيءَ سان روشن ڪيا ويا.ڪمري جي حرارت تي 20 منٽن لاء 10W LED.اهو طئي ڪرڻ لاءِ ته PDPL ۾ ڪهڙي قسم جي رد عمل واري آڪسيجن نسل شامل آهي، 0.5 mM وٽامن سي (MCE, #HY-B0166)، 5 mM Trolox (MCE, #HY-101445)، D2O (Sigma, #7789-20-0) , 100 ايم ايم مينيٽول (انرجي ڪيميڪل، #69-65-8)، 100 μM H2O2، 10 mM NaN3 سيلز ۾ اضافي طور شامل ڪيا ويا.ٿڌي PBS سان ڌوئڻ کان پوء، سيلز کي ڇڪايو ويو، 1.5 ml centrifuge tubes ۾ گڏ ڪيو ويو، ۽ 1 منٽ لاء 200 μl PBS ۾ 1x protease inhibitor سان EDTA کان سواءِ (1 s ۽ 1 s بغير، طول و عرض 35٪).نتيجو ڪندڙ مرکب 15,871 × g تي 10 منٽ لاءِ 4 °C تي سينٽرفيوج ڪيو ويو ۽ بي سي اي پروٽين جي اسي ڪٽ استعمال ڪندي سپرنيٽنٽ ڪنسنٽريشن 1 mg/mL تي ترتيب ڏني وئي.لڳ ڀڳ 50 µl مٿي ڏنل lysate کي 0.1 mM rhodamine azide (Aladdin, no. T131368)، 1 mM TCEP، 0.1 mM TBTA ligand، ۽ 1 mM CuSO4 1 ڪلاڪ لاءِ ڪمري جي گرمي پد تي هيٺ کان مٿي تائين گردش سان لڳايو ويو.ڪلڪ جي رد عمل کان پوءِ، 250 μl پري-ٿلڊ ايسٽون شامل ڪري، 250 μl پري-ٿلڊ ايسٽون شامل ڪري، 20 منٽ لاءِ -20 °C تي انڪيوب ڪندي ۽ 6010×g تي 10 منٽ لاءِ 4°C تي سينٽريفيوگ ڪندي، ايسٽون سان ورهاڱو ڪيو ويو.گولي گڏ ڪريو ۽ 50 µl 1x ليملي جي بفر ۾ 10 منٽ لاءِ 95 °C تي اُبالو.ان کان پوءِ نمونن جو تجزيو ڪيو ويو SDS-PAGE ڊگھي جيل تي ۽ تصويري ليب ٽچ سافٽ ويئر سان Bio-rad ChemiDoc MP ٽچ اميجنگ سسٽم استعمال ڪندي.
اظهار ۽ صاف ڪرڻ جي recombinant miniSOG-6xHis پروٽين جي طور تي اڳ بيان ڪيو ويو آهي.مختصر طور، E. coli BL21(DE3) سيلز (TransGen, #CD701-02) تبديل ڪيا ويا pET21a-miniSOG-6xHis سان ۽ پروٽين جو اظهار 0.5 ايم ايم IPTG (سانگون، #A600168) سان وڌايو ويو.سيل ليسس کان پوء، پروٽين کي صاف ڪيو ويو Ni-NTA agarose beads (MCE، نمبر 70666) استعمال ڪندي، PBS جي خلاف ڊائلائز ڪيو ويو، ۽ -80 ° C تي محفوظ ڪيو ويو.
اينٽي باڊي جي بنياد تي ويٽرو ليبل پروڪسميٽي اسي لاءِ، ملايو 100 μM صاف ٿيل miniSOG، 1 mM پروب 3، ۽ 1 μg اينٽي ليبل ماؤس مونوڪلونل اينٽي باڊي (TransGen, #HT501-01) PBS ۾ 50 μl جي ڪل رد عمل جي مقدار ۾..رد عمل جو مرکب نيري LED روشني سان 0، 2، 5، 10، ۽ 20 منٽ لاءِ ڪمري جي حرارت تي شعاع ڪيو ويو.اهو مرکب 0.1 mM بايوٽين-PEG3-azide (Aladdin, #B122225)، 1 mM TCEP، 0.1 mM TBTA ligand، ۽ 1 mM CuSO4 سان 1 ڪلاڪ لاءِ ڪمري جي گرمي پد تي مٿي واري حرڪت واري شيڪر تي لڳايو ويو.ٿوري رد عمل کان پوءِ، 4x ليملي جي بفر کي سڌو سنئون مرکب ۾ شامل ڪريو ۽ 10 منٽ لاء 95 ° C تي اڇو.نمونن جو تجزيو ڪيو ويو SDS-PAGE جيل تي ۽ تجزيو ڪيو ويو مغربي بلٽنگ سان streptavidin-HRP (1: 1000، Solarbio، #SE068).
سي-ٽرمينل اميڊيشن (LHDALDAK-CONH2) سان گڏ هڪ هسٽيڊائن تي مشتمل مصنوعي پيپٽائيڊ استعمال ڪيو ويو ويٽرو ليبلنگ ۾ ويجھي پيپٽائڊ جي بنياد تي تجزيو ڪرڻ لاءِ.هن جائزي ۾، 100 μM صاف ٿيل miniSOG، 10 ايم ايم پروب 3 ۽ 2 μg / ml مصنوعي پيپٽائڊ PBS ۾ 50 μl جي مجموعي ردعمل جي مقدار ۾ ملايا ويا.رد عمل جو مرکب نيري LED روشني سان 1 ڪلاڪ ڪمري جي حرارت تي شعاع ڪيو ويو.LC-MS سسٽم (Waters, SYNAPT XS Ions Mobility Time-of-Flight Mass spectrometer with MassLynx spectrum Analysis Software) استعمال ڪندي نموني جي ھڪڙي مائڪرو ليٽر جو تجزيو ڪيو ويو.
HEK293T سيلز مستقل طور تي miniSOG فيوزن جين کي ظاهر ڪن ٿا 10 سينٽي ڊشز ۾ ليڪن لاءِ مختلف آرگنيل لوڪلائيزيشن (ميٽو، اي آر، نيوڪلئس) ۽ پارڪن-مني ايس او جي ۽ BRD4-مني ايس او جي لائنن لاءِ 15 سينٽي ڊشز.~90٪ سنگم تي پهچڻ تي، سيلز کي HBSS سان هڪ ڀيرو ڌوئي ويو، پوءِ HBSS ۾ 37 ڊگري سينٽي گريڊ تي 1 ڪلاڪ لاءِ پروب 3 سان انڪيوبيو ويو ۽ ڪمري جي حرارت تي 10 W نيري LED سان روشن ڪيو ويو.پارڪن جي غير رابطي واري ليبلنگ لاءِ، 10 µM پروٽون ڪاربونيل سائانائيڊ ڪيريئر m-chlorophenylhydrazone CCCP (Solarbio, #C6700) پروب 3 سان HBSS ۾ 1 ڪلاڪ لاءِ 37°C تي شامل ڪيو ويو.سيل ليسس، ڪلڪ ڪيمسٽري، ريڊڪشن ۽ الڪيليشن جا مرحلا ساڳيا هئا جيئن مٿي بيان ڪيو ويو آهي، سواءِ ان جي ته 2 ملي گرام lysate شامل ڪئي وئي ۽ بايوٽين PEG3 azide استعمال ڪيو ويو ڪلڪ جي رد عمل ۾ فوٽو ڊيگريڊبل بايوٽين ايزائيڊ جي بدران.افزودگيءَ کان پوءِ، موتي کي 3 ڀيرا ڌويو ويو 5 ml PBS سان جنهن ۾ 0.2% SDS، 3 ڀيرا 5 ml PBS جنهن ۾ 1 M يوريا شامل هئي، ۽ 3 ڀيرا 5 ml PBS سان.ان کان پوء، 2 µg ٽرپسن 300 µl 25 mM ABC ۾ شامل ڪيو ويو جنهن ۾ 1 M يوريا شامل ڪئي وئي ته جيئن پروٽين کي رات جو 37 ° C تي ختم ڪيو وڃي.فارمڪ ايسڊ شامل ڪندي رد عمل کي روڪيو ويو جيستائين پي ايڇ 2-3 تائين پهچي ويو.موتي تي ٽريپسينائيزيشن کان پوء، پيپٽائڊ حل کي SOLAµ HRP ڪالمن (Thermo، #60209-001) استعمال ڪندي ختم ڪيو ويو ۽ اسپيڊ ويڪ ويڪيوم ڪنسنٽريٽر ۾ خشڪ ڪيو ويو.پيپٽائڊس کي 0.1٪ فارمڪ ايسڊ ۾ ٻيهر حل ڪيو ويو ۽ 500 اين جي پيپٽائڊس کي مٿي بيان ڪيل نانو-ESI ماخذ سان ليس Orbitrap Fusion Lumos Tribrid mass spectrometer استعمال ڪندي تجزيو ڪيو ويو.تجارتي RP-HPLC پريڪولس (75 μm x 2 cm) (Thermo، no. 164946) ۽ تجزياتي RP-HPLC ڪالمن (75 μm x 25 cm) (Thermo، no. 164941) تي پيپٽيڊس جدا ڪيا ويا، ٻئي 2 μm سان ڀريل.60 منٽن ۾ 8% کان 35% ACN تائين گريجوئيٽ، پوءِ 300 Nl/min جي وهڪري جي شرح تي 6 منٽن ۾ لڪيريءَ سان وڌي 98% B تائين.MS اسپيڪٽرا (350-1500 m/z) گڏ ڪيا ويا 60,000 جي ريزوليوشن سان، AGC 4 × 105، ۽ وڌ ۾ وڌ ان پٽ ٽائيم 50 ms.منتخب ٿيل آئنز کي ترتيب سان 3 s چڪر ۾ HCD پاران ورهايو ويو 30٪ جي معمولي ٽڪرائي واري توانائي سان، 1.6 m/z جي هڪ کواڊروپول آئسوليشن ونڊو، ۽ 15000 جو ريزوليوشن. A 5 × 104 tandem mass spectrometer AGC ٽارگيٽ ۽ وڌ ۾ وڌ انجيڪشن ٽائيم 22 ايم ايس استعمال ڪيا ويا.متحرڪ خارج ڪرڻ 45 سيڪنڊن تي مقرر ڪيو ويو آهي. غير تفويض ٿيل آئنز يا جيڪي 1+ ۽> 7+ جي چارج سان MS/MS لاءِ رد ڪيا ويا. غير تفويض ٿيل آئنز يا جيڪي 1+ ۽> 7+ جي چارج سان MS/MS لاءِ رد ڪيا ويا. Неназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. 1+ ۽>7+ جي چارج سان غير ترتيب ڏنل آئنز يا آئنز MS/MS لاءِ رد ڪيا ويا.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 离子被拒绝用于MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ 和>7+ 离子被拒绝用于MS/MS. Неуказанные ионы и ионы с зарядами 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. 1+ ۽>7+ جي چارجن سان اڻ ڄاڻايل آئنز يا آئنز MS/MS لاءِ رد ڪيا ويا.
NeutrAvidin موتي جي افزودگي تائين نموني تيار ڪرڻ جا قدم ساڳيا هئا جيئن مٿي بيان ڪيل LC-MS/MS تجزيي ۾.لڳ ڀڳ 50 μg lysate استعمال ڪيو ويو ان پٽ جي طور تي لوڊ ڪرڻ جي ڪنٽرول لاءِ ۽ 2 mg lysate استعمال ڪيو ويو ڪلڪ جي رد عمل لاءِ.نيوٽرا ويڊين سان افزودگي ۽ ڌوئڻ کان پوءِ، پابند پروٽينن کي 50 μl ليملي جي بفر کي ايگرز رال جي موتي ۾ شامل ڪري 95 ڊگري سينٽي گريڊ تي 5 منٽن لاءِ اُباليو ويو.ڪنٽرول لوڊ ان پٽ ۽ بيڊ اينچ ٿيل نمونن جو تجزيو ڪيو ويو SDS-PAGE ۽ PVDF جھلي (ملي پور، #ISEQ00010) کي معياري مغربي بلٽ طريقن سان.جھلين کي بلاڪ ڪيو ويو 5٪ اسڪيم کير سان (سنگون، #A600669) TBS ۾ 0.1٪ tween-20 (TBST) ۽ ترتيب سان پرائمري ۽ سيڪنڊري اينٽي باڊيز سان گڏ ڪيو ويو.پرائمري اينٽي باڊيز کي 1:1000 5٪ اسڪيم کير ۾ TBST ۾ ملائي ڇڏيو ويو ۽ رات جو 4 درجا سينٽي گريڊ تي انڪيوب ڪيو ويو.ثانوي اينٽي باڊيز 1 جي تناسب ۾ استعمال ڪيا ويا: 5000 ۽ ڪمري جي حرارت تي 1 ڪلاڪ لاءِ incubated.جھلي کي ڪيميلومينينس ذريعي استعمال ڪيو ويو Chemidoc MP اميجنگ سسٽم استعمال ڪندي.شڪل ۾ بلٽ ۽ جيل جا سڀئي اڻ کٽ اسڪين خام ڊيٽا طور پيش ڪيا ويا آهن.
هن مطالعي ۾ استعمال ٿيل پرائمري اينٽي باڊيون شامل آهن خرگوش مخالف SFPQ مونوڪلونل اينٽي باڊي (CST، نمبر 71992)، خرگوش اينٽي FUS مونوڪلونل اينٽي باڊي (CST، نمبر 67840)، خرگوش مخالف اين ايس يو اين 2 پولي ڪلونل اينٽي باڊي (پروٽينٽيڪ، نمبر 20854-1- AP)، خرگوش مخالف mSin3A پولي ڪلونل اينٽي باڊي (Abcam, #ab3479)، ماؤس اينٽي ٽيگ مونوڪلونل اينٽي باڊي (ٽرانس جين، #HT201-02)، ماؤس اينٽي β-ايڪٽين مونوڪلونل اينٽي باڊي (ٽرانس جين، #HC201-01)، خرگوش مخالف -CDK2 monoclonal antibody (ABclonal, #A0094), rabbit monoclonal antibody to CTBP1 (ABclonal, #A11600), rabbit polyclonal antibody to DUT (ABclonal, #A2901), rabbit polyclonal antibody to PSMC4 (ABclonal, #A2505)، خرگوش پولي ڪلونل اينٽي باڊي. DNAJB1 پولي ڪلونل اينٽي باڊي (ABclonal، # A5504).اهي اينٽي باڊيون استعمال ڪيون ويون 1:1000 تي 5٪ اسڪيم کير ۾ TBST ۾.هن مطالعي ۾ استعمال ٿيل ثانوي اينٽي باڊيز شامل آهن اينٽي ريبيٽ IgG (TransGen, #HS101-01), اينٽي ماؤس IgG (TransGen, #HS201-01) هڪ 1:5000 dilution تي.
وڌيڪ تحقيق ڪرڻ لاءِ ته ڇا BRD4 SFPQ سان رابطو ڪري ٿو، مستحڪم HEK293T ۽ BRD4-miniSOG سيلز HEK293T کان وڌيڪ ايڪسپريس ڪندي 10 سينٽي وينجن ۾ پليٽ ڪيا ويا.سيلز کي ٿڌو پي بي ايس سان ڌوئي ويو ۽ 1 ml پئرس IP ليسس بفر (Thermo Fisher, #87787) ۾ 30 منٽن لاءِ 4°C تي EDTA-free protease inhibitor سان ڌوئي ويو.ان کان پوء، 1.5 ml سينٽرفيوج ٽيوب ۾ lysates گڏ ڪيو ويو ۽ 15,871 xg تي 10 منٽ لاء 4 ° C تي سينٽرفيوج ڪيو ويو.سپرنيٽنٽ کي 5 µg اينٽي V5 ليبل ٿيل ماؤس مونوڪلونل اينٽي باڊي (CST، #80076) سان گڏ ڪيو ويو ۽ رات جو 4 ° C تي.تقريبن 50 µl پروٽين A/G مقناطيسي موتي (MCE, #HY-K0202) کي ٻه ڀيرا PBS سان ڌوئي جنهن ۾ 0.5% Tween-20 شامل آهن.پوءِ سيل ليسيٽس کي مقناطيسي موتي سان 4 ڪلاڪن تائين 4 ڊگري سينٽي گريڊ تي هيٺان کان مٿي تائين گردش سان لڳايو ويو.ان کان پوءِ موتي کي چار ڀيرا ڌويو ويو 1 ml PBST بفر سان ۽ 95 ° C تي 5 منٽن لاءِ اُباليو ويو.SDS-PAGE جيل تي نمونن جو تجزيو ڪيو ويو ۽ معياري مغربي بلٽ طريقن کي استعمال ڪندي PVDF جھلي ڏانهن منتقل ڪيو ويو.جھليون TBST ۾ 5٪ اسڪيم کير ۾ بند ڪيون ويون آھن ۽ ترتيب وار پرائمري ۽ سيڪنڊري اينٽي باڊيز سان پکڙيل آھن.پرائمري اينٽي باڊي ريبيٽ اينٽي SFPQ مونوڪلونل اينٽي باڊي (CST، #71992) استعمال ڪيو ويو 1:1000 جي تناسب ۾ 5٪ اسڪيم کير ۾ TBST ۽ رات جو 4 ° C تي انڪيوبيو ويو.مخالف خرگوش IgG 1 جي تناسب تي استعمال ڪيو ويو: 5000 ۽ ڪمري جي حرارت تي 1 ڪلاڪ لاء انڪيوبيو ويو.جھلي کي ڪيميلومينينس ذريعي استعمال ڪيو ويو Chemidoc MP اميجنگ سسٽم استعمال ڪندي.
سڀ ڍانچي استعمال ڪيا ويا سولوينٽ Accessible Surface Area (SASA) تجزيي لاءِ حاصل ڪيا ويا پروٽين ڊيٽا بئنڪ (PDB)52 يا AlphaFold پروٽين جي جوڙجڪ ڊيٽابيس 53 مان.Absolute SASA حساب ڪيو ويو هر رهائش لاءِ FreeSASA پروگرام استعمال ڪندي.صرف مڪمل ۽ غير واضح SASA ڊيٽا ليبل ٿيل هسٽيڊائن ۽ ان جي پاڙيسرين لاءِ استعمال ڪيا ويا هر ڍانچي لاءِ مطلب SASA حاصل ڪرڻ لاءِ.هر هسٽيڊائن لاءِ لاڳاپو سولوينٽ رسائي (RSA) حساب ڪيو ويو مطلق SASA قدر کي ورهائي تجرباتي وڌ ۾ وڌ ممڪن رهائشي مٿاڇري واري علائقي طرفان محلول وٽ موجود.سڀ هسٽائڊائنس پوءِ لڪايل جي طور تي درجه بندي ڪيون ويون جيڪڏهن مطلب RSA 20٪ کان گهٽ هو، ٻي صورت ۾ ظاهر ڪيو ويو 56.
DDA موڊ ۾ حاصل ڪيل خام فائلون Proteome Discoverer (v2.5) يا MSfragger (Fragpipe v15.0) استعمال ڪندي ڳوليا ويا مناسب SwissProt تصديق ٿيل پروٽين ڊيٽابيس ۾ عام آلودگي تي مشتمل.پيپٽائڊس کي ٻن گم ٿيل ڪليويج سائيٽن سان مڪمل ٽريپسن جي ضرورت هئي، ڪارباموائل ميٿيليشن هڪ مقرر ٿيل ترميم جي طور تي ۽ ميٿيونائن آڪسائيڊشن کي متحرڪ ترميم جي طور تي.اڳڪٿي ۽ ٽڪرا وزن رواداري ترتيب ڏني وئي 10 ppm ۽ 0.02 Da (MS2 Orbitrap)، ترتيب سان. Contaminant هٽ هٽايو ويو، ۽ پروٽين کي فلٽر ڪيو ويو ته <1٪ جي غلط دريافت جي شرح حاصل ڪرڻ لاء. Contaminant هٽ هٽايو ويو، ۽ پروٽين کي فلٽر ڪيو ويو ته <1٪ جي غلط دريافت جي شرح حاصل ڪرڻ لاء. Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы, чтобы получить коэфициент ложного %. آلودگي واري هٽ کي هٽايو ويو ۽ پروٽين کي فلٽر ڪيو ويو ته <1٪ جي غلط ڳولڻ جي شرح ڏيو.去除污染物命中,过滤蛋白质以获得<1%的错误发现率. <1% 错误发现率. Попадания загрязняющих веществ были удалены, а белки отфильтрованы для достижения уровня ложных обнаружений %1. آلودگي واري هٽ کي هٽايو ويو ۽ پروٽين کي فلٽر ڪيو ويو هڪ غلط مثبت شرح حاصل ڪرڻ لاء <1٪.ليبل جي استعمال کان سواء مقدار جي تجزيي لاء، ٽن حياتياتي ورهاڱي کان عام پروٽين جي مواد کي استعمال ڪيو ويو.پروٽين جي ذيلي سيلولر لوڪلائيزيشن تجزيو استعمال ڪيو ويو جين آنٽولوجي (GO) تجزيو DAVID Bioinformatics Resources، MitoCarta 3.0 ۽ ڊيٽابيس پاران مرتب ڪيل ۽ شايع ٿيل ايلس ٽنگ گروپ پاران.آتش فشان جو نقشو Perseus کان حاصل ڪيو ويو (v1.6.15.0). پروٽين جي گھڻائي واري ڦيرڦار کي ٻن رخا ٽي-ٽيسٽ استعمال ڪندي شمارياتي اھميت لاء آزمائيو ويو، ۽ پروٽين ھٽ جي سڃاڻپ ڪئي وئي گھڻائي تبديلي سان> 2 (جيستائين ٻي صورت ۾ بيان نه ڪيو ويو آھي) ۽ پي قدر <0.05. پروٽين جي گھڻائي واري ڦيرڦار کي ٻن رخا ٽي-ٽيسٽ استعمال ڪندي شمارياتي اھميت لاء آزمائيو ويو، ۽ پروٽين ھٽ جي سڃاڻپ ڪئي وئي گھڻائي تبديلي سان> 2 (جيستائين ٻي صورت ۾ بيان نه ڪيو ويو آھي) ۽ پي قدر <0.05. Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы с изменением содержания> 2 (если не указано иное) и значением p <0,05. پروٽين جي مواد جي فولڊ تبديلين کي شمارياتي اهميت لاء ٽيسٽ ڪيو ويو هڪ ٻه-ٽيل ٽي-ٽيسٽ استعمال ڪندي، ۽ پروٽين جي ميچز مواد جي تبديلي سان سڃاڻپ ڪئي وئي > 2 (جيستائين ٻي صورت ۾ نوٽ نه ڪيو وڃي) ۽ اي پي قدر <0.05.使用 双边 检验 检验 检验 检验 测试 蛋白质 丰度 测试 中 显着性 统计 显着性 显着性 说明 说明 说明 说明 说明 说明 说明 <值 <0.05.使用 双边 检验 检验 检验 检验 测试 蛋白质 的 蛋白质 中 中 的 显着性 显着性 和 并 和 并 和 和 和 和 <值 <0.05. Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иное) и p-значений <0,05. پروٽين جي مواد ۾ فولڊ تبديلين جي شمارياتي اهميت هڪ ٻه-ٽيل ٽي-ٽيسٽ استعمال ڪندي آزمائي وئي، ۽ پروٽين جي ميچز مواد جي تبديلين لاء مقرر ڪيا ويا> 2 (جيستائين ٻي صورت ۾ اشارو نه ڪيو ويو هجي) ۽ p-values ​​<0.05.پروٽين جي رابطي جو تجزيو GO تجزيي سان گڏ اسٽرنگ ڊيٽابيس سان گڏ استعمال ڪيو ويو.
ساڳي نتيجن سان گڏ ٽي حياتياتي نقل ڪيا ويا.انگن اکرن جو تجزيو GraphPad Prism (GraphPad سافٽ ويئر) سان ڪيو ويو ۽ آتش فشاني پلاٽ Perseus (v1.6.15.0) سان ٺاهيا ويا.ٻن گروپن جو مقابلو ڪرڻ لاءِ، p-values ​​جو تعين ڪيو ويو هڪ ٻه-tailed Student's t-test استعمال ڪندي.تجرباتي گروپ ۾ گهٽ ۾ گهٽ ٻه ڀيرا سڃاڻپ صرف سنگلٽن پروٽين کي آتش فشاني پلاٽ ۾ شامل ڪيو ويو، ۽ ڪنٽرول گروپ ۾ لاڳاپيل غائب قدرن کي عام تقسيم کان Perseus سان تبديل ڪيو ويو ته جيئن p-value جو اندازو لڳائي سگهجي.نقص بار جي نمائندگي ڪن ٿا مطلب ± معياري انحراف.شمارياتي تجزيي لاءِ پروٽوڪول تجزين ۾، پروٽين جي گهڻائي جيڪا گهٽ ۾ گهٽ ٻن حياتياتي نقلن ۾ ظاهر ٿئي ٿي، برقرار رکيو ويو.شمارياتي طريقا استعمال نه ڪيا ويا هئا نموني جي ماپ کي اڳ ۾ مقرر ڪرڻ لاء.تجربا بي ترتيب نه آهن.محقق نتيجن جي تجربن ۽ تشخيص دوران ڪمن تي انڌا نه هئا.
مطالعي جي ڊيزائن تي وڌيڪ معلومات لاء، ڏسو فطرت ريسرچ رپورٽ خلاصو هن مضمون سان ڳنڍيل آهي.
هن مطالعي ۾ حاصل ڪيل ماس اسپيڪٽروميٽري ڊيٽا ڊيٽا سيٽ ID PXD034811 (PDPL-MS ڊيٽا سيٽ) تحت iProX57 پارٽنر مخزن ذريعي ProteomeXchange Consortium ڏانهن جمع ڪئي وئي.خام ڊيٽا خام ڊيٽا فائلن جي صورت ۾ مهيا ڪيل آهن.هي آرٽيڪل اصل ڊيٽا مهيا ڪري ٿو.
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. پاڙيسري کي ڄاڻڻ لاءِ: پروٽين ڪمپليڪسز ۽ ميپ آرگنيلز کي خاص ڪرڻ لاءِ قربت-انحصار بايوٽينيليشن استعمال ڪندي. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. پاڙيسري کي ڄاڻڻ لاءِ: پروٽين ڪمپليڪسز ۽ ميپ آرگنيلز کي خاص ڪرڻ لاءِ قربت-انحصار بايوٽينيليشن استعمال ڪندي.Gingras, AS, Abe, KT ۽ Raut, B. ماحول سان واقفيت: پروٽين ڪمپليڪس ۽ نقشي جي آرگنيلز کي خاصيت ڏيڻ لاء قربت-انحصار بايوٽينيليشن استعمال ڪندي. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. پاڙيسري کي سمجھڻ: حياتياتي زندگي تي پاڙيسري جو انحصار استعمال ڪريو.Gingras, AS, Abe, KT and Raut, B. سمجھڻ قربت: پروٽين ڪمپليڪس جي خصوصيت ۽ قربت-انحصار بايوٽينيليشن استعمال ڪندي آرگنيلز جو نقشو.موجوده.منهنجي خيال ۾.ڪيميائي.حياتيات 48، 44-54 (2019).
گيري، جي بي وغيره.Dexter توانائي کي مدافعتي سيلز ڏانهن منتقل ڪندي مائڪرو ماحوليات جو نقشو.سائنس 367، 1091-1097 (2020).
Hertling, EL et al.ٻه-پروٽوم اسڪيل نيٽ ورڪ انساني رابطي جي سيل-مخصوص ريموڊلنگ کي ڳوليندا آهن.سيلز 184، 3022–3040.e3028 (2021).